细胞毒性T淋巴细胞

细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell，Tc或CTL），也称杀伤性T细胞，分为效应细胞毒性T细胞和记忆细胞毒性T细胞。前者能特异性杀伤带抗原的靶细胞，如移植细胞、肿瘤细胞及受微生物感染的细胞等。Tc细胞的杀伤力较强，可反复杀伤靶细胞，而且在杀伤靶细胞的过程中本身不受损伤。当它们和靶细胞接触后，能释放穿孔素，嵌入靶细胞膜内形成多聚体穿膜管状结构，细胞外液便可通过此管状结构进入靶细胞，导致细胞溶解。Tc细胞还能分泌颗粒酶，从小孔进入靶细胞，诱发靶细胞凋亡。

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cyto-toxic T-lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4)是活化T细胞表面所表达的一种膜结合蛋白,最早由Brunet等在筛选小鼠杀伤性T细胞的cDNA扣除文库(subtract-ed library)时发现。随后的研究表明, CT-LA-4是第二信号系统B细胞激活抗原(B7)分子的受体之一。最近,人们才认识到辅助刺激因子(co-stimulating factor, CoF)在某些情况下受配对受体的正负调节,从而使T细胞向活化(activation)及失活化(anergy)两个不同的方向发展,产生不同的生物学效应。这一发现使人们对免疫调节在分子水平上又有了更深入的认识,并可由此设计、发展新的免疫调变技术和药物来防治某些疾病。

越来越多的研究显示ＣＴＬＡ-4基因在Ｔ1ＤＭ的发生中发挥重要的作用,但其确切的机制尚不明了,在上述各种研究中可以发现,在不同人群中,ＣＴＬＡ-4基因多态性与Ｔ1ＤＭ的相关性研究结果常常不尽一致,这可能与各研究者对疾病表型的定义标准不一、疾病的遗传异质性、各人群的遗传结构有差异、样本量过小以及环境风险因素的干扰等有关。并且,在国外的研究中,在不同种族或不同人群中易感基因相关位点的相互作用也不尽相同,中国北方及西北的汉族Ｔ1ＤＭ大多与+49Ｇ相关,南方汉族及少数民族是否也与之相关,其遗传差异还有待进一步研究与探讨。

CTL增殖能力的检测

常用四甲基偶氮唑盐法检测抗原特异性CTL的增殖,也可通过检测CTL前体细胞频数的方法来反映其功能。前体T细胞遭遇抗原后增殖,其频数可反映T细胞库中某一抗原特异T细胞的比率,可作为体外检测对某抗原细胞免疫反应强弱的一项重要指标。多用放射性示踪剂标记前体细胞,检测其增殖后的放射性标记的量,也可使用荧光染料结合流式细胞仪分析:将含特异前体细胞的标本用荧光染料处理,由于细胞分裂增殖后染料的平均分配,可通过荧光度的高低来推测细胞周期的数目,再用流式细胞仪检测每一代细胞数,最初的前体T细胞频数就能被计算出来。流式细胞仪能检出1 105细胞的增殖,敏感性较高,可分辨应答细胞的表型,而且通过使用不同荧光染料可同时检测几种T细胞。不过该法实验周期较长,且不能检测失能T细胞,使测定值偏低。

1.细胞因子检测　 活化的CTL分泌功能性细胞因子,如IL-2、干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)等,通过检测细胞因子的分泌情况可反映T细胞的活性。

2. 固相酶联斑点法(Enzyme-linked immunospot,ELISPOT)

基于酶联免疫标记技术的基本原理建立的ELISPOT技术不仅灵敏度大为提高,而且能得到分泌细胞因子的细胞频数。CTL受抗原刺激后一旦分泌功能性细胞因子,就被预包被的抗体直接捕获,通过局部形成的斑点数目得出分泌细胞因子的T细胞频数,从而反映抗原特异性CTL的活性。Kim-berly等比较了分别检测颗粒酶B和IFNγ的ELISPOT法和51Cr释放法,实验结果显示三者相关性较好,并指出检测颗粒酶B的ELIS-POT法比IFNγ更快速更直接;ELISPOT法所需细胞少,鉴定抗原表位效率很高。Bilhl等使用循环ELISPOT技术,即将实验中未形成斑点的细胞回收,用少于10mL的外周血标本,检测人类免疫缺陷病毒、EB病毒、巨细胞病毒、乙肝及丙肝病毒等5种病毒的近400个CTL表位引起的抗病毒免疫,结果显示与普通ELISPOT检测没有显著差异,可用于评价多重病毒感染引起的细胞免疫。但除了CTL,一些辅助T淋巴细胞(CD+3和CD+4)、自然杀伤细胞等也可分泌相同的细胞因子,故还需结合细胞表型的分析;另一方面,实验中功能不活跃的或分泌其他细胞因子的CTL会被忽略,细胞频数将被低估。另外,此法较酶联免疫标记法昂贵,如果细胞产生大量细胞因子,则选用酶联免疫标记法较为经济。

3.流式细胞仪胞内细胞因子分析法 ELISPOT间接地提供分泌某细胞因子的CTL数目,如要更为准确的信息,可以用流式细胞仪胞内细胞因子分析法。Jung等采用莫能星(Mo-nesin)等药物预孵的方法,阻断胞内高尔基体介导细胞因子的转运,使其在细胞内蓄积,信号增强,然后应用两种免疫荧光抗体分别标记CTL表面的亚群标志分子和胞内细胞因子,用流式细胞仪进行检测和分析,即可得到不同T细胞亚群某一细胞因子的分泌情况。如采用多色荧光标记系统,可同时分析单个细胞内多种细胞因子的分泌情况,既提高效率更可减少误差。该法优势有:①快速,实验流程只需6～8h;②简便准确,无需组织培养,可以全血分析,也不需分离外周血单核细胞,接近生物体内的分析条件,可直接定量;③灵敏度高;④高效,该法是目前惟一能同时测定细胞表型及细胞因子类型的检测技术。因此,该法被较广泛地用于抗原表位的鉴定、疫苗效果的分析或比较等方面[11,12]。

CTL杀伤力的检测

同位素释放法以放射性标记物标记靶细胞,被效应细胞攻击后释放同位素,通过检测上清中放

射性核素每分钟闪烁计数值来评估效应细胞的杀伤力。经典的51Cr释放实验在近30年来一直被认为是CTL活性检测的“金标准”,但因安全性不佳,近年来已较少使用。乳酸脱氢酶法是常用的检测细胞毒活性的简便方法:靶细胞受到CTL攻击后胞膜受损,释放乳酸脱氢酶,催化乳酸形成丙酮酸盐,与四甲基偶氮唑盐类反应形成紫色的结晶物质,用酶标仪检测间接判断细胞受损的程度。乳酸脱氢酶释放试验与51Cr释放法相关性良好,且具有自然释放率低、操作简便和不存在同位素污染的优点,被广泛使用。不过该法影响因素较多,诸如培养基、酸碱度、温度、加底物显色时间和终止剂等,稳定性不够。杀伤力分析的方法具有直接和特异的优点,但是要求有大量的特异性CTL作为效应细胞,且T细胞需要经过体外刺激增殖,致使这类方法周期长、费时费力、敏感性低,而且只可定性、间接定量CTL的活性,不够精确。