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组织学/免疫细胞化学术
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{{Hierarchy header}} [[免疫细胞化学]](immunocytochemistry)术是应用[[抗原]]与[[抗体]]结合的[[免疫学]]原理,检测细胞内[[多肽]]、[[蛋白质]]及膜[[表面抗原]]和[[受体]]等大分子物质的存在与分布。这种方法特异性强,敏感度高,进展迅速,应用广泛,成为[[生物学]]和医学众多学科的重要研究手段。近年随着[[纯化]]抗原和制备[[单克隆抗体]]的广泛开展以及标记技术不断提高,免疫细胞化学的进展更是日新月异,不仅用于许多基本理论的研究,并取得重大突破,而且也用于[[疾病]]的早期快速诊断等临床实际。组织的多肽和蛋白质种类繁多,具有[[抗原性]]。分离纯化人或动物组织某种蛋白质,作为抗原注入另一种动物体内,后者即产生相应的[[特异性抗体]]([[免疫球蛋白]])。从被[[免疫]]动物的[[血清]]中提取出该抗体,再以[[荧光素]]、酶、[[铁蛋白]]或[[胶体]]金标记,用这种标记抗体处理[[组织切片]]或[[细胞]],标记抗体即与细胞的相应蛋白质(抗原)发生特异性结合(图1-4)。常用的荧光素是[[异硫氰酸荧光素]](FITC)和四甲基异硫氰酸[[罗丹明]](TRITC),在[[荧光显微镜]]下可观察[[荧光抗体]]抗原[[复合物]](图1-5)。常用的酶是[[辣根]]过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP,从[[辣根菜]]中提取的),它的[[底物]]是3,3<sup>'</sup>-二氨基、[[联苯胺]](DAB)和H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>,HRP使DAB氧化形成棕黄色产物,可在光镜和电镜下观察(图1-6)。铁蛋白和胶体金标记抗体与抗原的结合,也可在光镜和电镜下观察(图1-7)。 {{图片|gunkas1i.jpg|[[大鼠]][[腺垂体]]免疫组织化学(PAS法)示[[生长激素]]细胞 }} 图1-6 大鼠腺垂体免疫组织化学(PAS法)示生长激素细胞 (上海医科大赵培林教授供图) {{图片|gunkautr.jpg|免疫细胞化学([[蛋白]]A-胶体金法)和[[原位杂交]]术示大鼠[[垂体]] }} 图1-7 免疫细胞化学(蛋白A-胶体金法)和原位杂交术示大鼠垂体 [[催乳素]]细胞电镜像 N催乳素[[细胞核]] ↑分泌颗粒内显示金粒 {{图片|gunkamvf.gif|[[粗面内质网]](RER)显示银粒 }} 粗面内质网(RER)显示银粒 (加拿大Douglas[[医院]]研究中心童毅爱博士赠图) 标记抗体民被检抗原的结合方式有两种。一是直接法,即如上述用标记抗体与样品中的抗原直接结合(图1-8)。这种方法操作简便,但敏感度不及间接法。间接法是将分离的抗体(第一抗体简称一抗)再作为抗原免疫另一种动物,制备该抗体(抗原)的抗体(第二抗体简称二抗),再以[[标记物]]标记二抗。先后以一抗和标记二抗处理样品,最终形成抗原一抗-标记二抗复合物(图1-8)。间接法中的一个抗原[[分子]]可通过一抗与多个标记二抗相结合,因此它的敏感度较高,而且目前国内外均有多种标记二抗商品供应,使用方便。间接法中较常用的是一种称之为[[过氧化物酶]]-抗过氧化物酶[[复合物法]](peroxidase-antiperoxidase complexmethod,PAS法),该法除需一抗和二抗外,还需制备HRP标记的抗酶抗体,即以HRP作为抗原免疫动物,制成抗HRP抗体,再以HRP标记该抗体制成由3个酶分子与2个抗酶抗体组成的相当稳定的环形PAP复合物。[[标本]]先后以一抗、二抗和PAP复合物处理后,再以DAB显色,即可检测抗原的分布。此法由于细胞内的抗原通过抗体的层层放大而与多个酶分子结合,因此敏感性很强(图1-9)。 {{图片|gunkak3w.jpg| 免疫细胞化学直接法(A)与间接法(B)示意图}} 图1-8 免疫细胞化学直接法(A)与间接法(B)示意图 {{图片|gunkah70.jpg| 免疫细胞化学PAP法示意图}} 图1-9 免疫细胞化学PAP法示意图 免疫细胞化学术近10年来又有新进展,如[[生物素]]-亲合素等新颖[[试剂]]的应用,为检测微量抗原、受体、抗体开辟了新途径。生物素(biotin)又称[[维生素H]],是从[[卵黄]]和肝中提取的一种[[小分]]子物质([[分子量]]244.31);亲合素(avidin)又称卵白素,是从卵白中提取的一种[[糖蛋白]](分子量68kD)。每个亲合素分子有生物素结合的4个[[位点]],二者可牢固结合成不可逆的复合物。生物素-亲合素的应用大致有三种方法。①标记亲合素-[[生物素法]](labelled avidin- biotin method,LAB法):将亲合素与标记物(HRP)结合,一个亲合素可结合多个HRP;将生物素与抗体(一抗与二抗)结合,一个抗体分子可连接多个生物素分子,抗体的活性不受影响。细胞的抗原(或通过一抗)先与生物素化的抗体结合,继而将标记亲合素结合在抗体的生物素上,如此多层放大提高了检测抗原的敏感性(图1-10)。②桥连亲合素-生物素法(bridged avidin-biotin method,BAB法):先使抗原与生物素化的抗体结合,再以游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接,也达到多层放大效果(图1-10)。③亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidase complexmethod,ABC法);此法是前两种方法的改进,即先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起,形成亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC复合物),标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合,最终形成晶格样结构的[[复合体]],其中网络了大量酶分子,从而大大提高了检测抗原的灵敏度(图1-10)。现有配制现成的ABC药盒商品供应,操作简便,是目前广泛应用的一种方法。 {{图片|gunkap8z.jpg|生物素-亲合素免疫细胞化学示意图 }} 图1-10 生物素-亲合素免疫细胞化学示意图 (1)标记亲合素-生物素法 (2)桥连亲合素-生物素法 (3)亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法(ABC法) {{Hierarchy footer}} {{组织学图书专题}}
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