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基因诊断与性病/生殖器疱疹
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{{Hierarchy header}} [[生殖器疱疹]]是由[[单纯疱疹病毒]](Herpes Simplex Virus ,HSV)I型、Ⅱ型所致性病之一。近年来[[发病率]]明显升高。在国内它还属性病中新一代成员,人们对它的危害性没有足够的认识。单纯疱疹病毒可引起[[皮肤]]、粘膜及多种器官[[感染]]。它可以通过[[性接触感染]]而发生生殖器疱疹(Genital herpes)。生殖器疱疹[[病毒]]有两个[[血清型]];HSV-I和HSV-Ⅱ。大多数生殖器疱疹由HSV-Ⅱ引起,本病可呈慢性复发过程,目前尚未有根治的良药。目前HSv 成为不少国家和地区[[生殖器溃疡]]的首要病因,同时还和[[宫颈癌]]的发病及[[新生儿]][[疱疹]]病的传染有关。 ==第一节 [[病因学]]== 单纯疱疹病毒属于[[病毒科]],直径180nm,是较大的[[DNA]]病毒。它可以分为HSV-1和HSV-2两个亚型,它们在[[生物学]]、自然属性以及人类对它们的[[免疫]]方面存在着不同。但这两个亚型感染引起的[[病理]]生理却相同。HSV的[[核酸]]结构为双股线状DNA,每股DNA分长、短两个部分。[[分子量]]约为100×106道尔顿,15万硷基对,可编码60个以上的[[基因产物]]。在DNA病毒中,单纯疱疹病毒[[基因]]结构具有特殊性,因为它的两个独立的[[核苷酸序列]]两侧有倒置的[[重复序列]],这两个核苷酸序列能够互相倒置联系,病毒DNA有四种[[异构体]]。HSV-1和HSV-2的[[病毒基因]]有50%左右的[[同源性]]。 HSV病毒形态呈球形,病毒[[核衣壳]]表面是由162个[[壳微粒]]组成的对称20面体(100-110nm),其内是由DNA组成的核心,[[蛋白质]]外壳包绕着[[病毒基因组]],外面有一层[[脂膜]]。在衣壳和[[包膜]]之间是一种多[[蛋白]]组成的[[被膜]]。HSV有三类基因,分别为α、β和γ基因。HSV感染[[神经细胞]]但不造成[[细胞死亡]],病毒在感染细胞内处于抑制状态,被感染[[细胞]]的存活与功能也不受影响,把这一过程称为潜伏。病毒基因激活后病毒开始复制,有时可形成疱疹性损害,这一过程称为复发。潜伏感染[[神经元]][[细胞核]]内有大量的两种[[RNA]][[转录]]体,它们与称作ICP-O的直接早期(α)基因产物重叠,这些RNA转录体按“反义”方向编码,表示它们可能是β和γ蛋白转录的[[抑制因子]],当病毒处于潜伏状态时,其复活能力也被降低,对病毒潜伏的[[分子]]机理的了解可能有助于为预防HSV复发找到新途径。 ==第二节 基因结构== 一、[[基因组]]结构 HSV-2基因组为双链线性DNA分子,[[碱基组成]]含69%G+C,分子量为96×106D。根据基因组两个通过[[共价键]]相连的分别被称为L(长)和S(短)的组分的方位不同,HSV-2DNA可有四种异构体。L组分包括82%的病毒DNA,并且有一独特序列“U”,其两侧有一反转重复区域ab或b′a′,分别含6%病毒DNA。S组分占18%的病毒DNA,也有一独特序列(US),其两侧亦有反转重复序列a′c′和ca。a′c′和ca分别含4.3%DNA。彼此相关的L和S序列的倒置衍生于[[位点]]特异性[[重组]],重组是由末端“a”序列区的病毒基因产物介导的。HSV-2DNA两端可连接成环状,此结构与病毒的致癌与潜伏有关。HSV-2DNA中L和S的[[末端重复]]序列主要编码特定的即刻早期[[转录产物]],而独特序列主要编码特定的早期及晚期[[多肽]]和[[糖蛋白]]。 HSV-2有三类基因,即α、β、γ。其中α基因在感染中最早表达且不需要前[[病毒蛋白]]的合成;β基因的感染需要α蛋白的预先合成;γ基因的表达需要病毒DNA的复制。现已证实HSVmRNA可合成三类基本蛋白:急早期(immediate early,α)、早期(early,β)和晚期(late,γ)蛋白,β蛋白在DNA复制中起作用,包括[[胸苷激酶]],DNA[[多聚酶]]及大多数DNA[[结合蛋白]],而大部分糖蛋白则多为γ蛋白。HSV-2[[蛋白合成]]呈连锁调节,即α基因产物诱导β[[基因表达]],而β基因产物(加上一种α蛋白ICOP4)反过来又可终止α基因表达,同时诱导γ基因的表达,γ基因产物则可负调节β基因的表达并且可作为下一轮[[病毒复制]]合成α蛋白的起始信号。 迄今为止,已有6个编码糖蛋白的基因已定位于HSV-2线性位点上,其基因产物分别被命名为gB、gC、gD、gE、gG和gH,编码gB、gC的基因位于UL区,而编码gD、gE、gG和gH的US区。 二、与诱导细胞转化有关的[[基因定位]] Aurelian对所有实验中HSV-2感染的[[细胞株]](包括肿[[癌细胞]]株)作了分析,发现病毒DNA共有的序列仅两处,一处是Bg1ⅡG片段,位于0.21-0.33图单位,该DNA序列与感染细胞在低[[血清]][[培养剂]]中的[[增殖]]有关,而与病毒致癌无关;另一处是Bg1ⅡC片段,位于0.45~0.58图单位,能诱导细胞转化.HSV-2诱导[[仓鼠]][[胚胎]][[成纤维细胞]]转化的DNA区域位于Bg1Ⅱ/Hpal-CD片段,相当于0.44~0.52图单位.HSV-2DNA的Bb1ⅡN片段位于0.58~0.63图单位,为形态学转化区,已知0.58~0.628中无特定的编码功能.L+K-细胞株或3T3tk-细胞株能通过HSV-2感染转化成TK+[[表型]],导致转化所需的HSV-2DNA序列位于0.28-0.32图单位。 ==第三节 [[流行病学]]== 目前生殖器疱疹的流行情况在STD中非常引人注意,它已成为欧美最常见的性病之一。如英国自1971年的4000例增至1985年的20000例。在美国,1966-1984年已增加了15倍。估计美国人群累计病例超过3000万。本病占STD中第5位(7.7% ==第四节 [[免疫学]]== 患者机体对感染HSV的反应如何将直接影响机体是否发病及感染的严重程度、潜伏感染的发展和维持及HSV复发频率。如患者有[[细胞免疫]]缺陷和[[体液免疫]]缺陷的HSV感染病情较为严重,说明[[抗体]]介导和细胞介导的[[免疫反应]]对HSV患者十分重要。动物实验证明,T[[淋巴细胞]],NK细胞和[[巨噬细胞]]在防止HSV扩散中起主要作用,抗体则有助于减低[[神经组织]]中病毒的含量。 在一定的条件下,特异性HSV[[多克隆抗体]],HSV[[单克隆抗体]],已接触HSV[[抗原]]的淋巴细胞及针对病毒抗原克隆的T细胞都具有保护不患[[神经系统疾病]]或[[神经节]]潜伏感染。[[宿主]]的免疫反应在HSV发病机理方面可能也起一定的作用,HSV抗原的细胞免疫反应涉及多种细胞,如[[自然杀伤细胞]]、巨噬细胞、T[[淋巴细胞亚群]]和由这些细胞产生的[[淋巴因子]]。给动物被动输入已接触过HSV抗原的淋巴细胞,再用病毒攻击,动物可得到保护而不发病。最大保护作用需激活多种T细胞[[亚群]]。 通过对疱疹病损研究表明,CD8T淋巴细胞参与感染的控制,新生儿感染HSV时,其γ-[[干扰素]]的表达就显著延缓。干扰素可能有直接的抗病毒效应或者可能激活其他非特异性[[效应细胞]]。 原发感染时,用[[放射免疫测定法]]和抗体依赖[[细胞毒试验]],在[[症状]]出现4天可检测到HSv IgG抗体。而不依赖补体中和抗体和CF抗体通常要在症状出现后2-3周才测到。感染早期可测到HSV特异性IgM,IgM持续8周,但在潜伏感染及无症状感染者中则测不到IgM。一般情况下,无症状感染者和将复发疱疹者的HSv IgG、IgM或IgA[[抗体滴度]]无差异。 最近IgG亚型抗体的检测,对IgG在生殖器疱疹的初感染、再发等也可检出,而IgG2、3、4,在初感染中却不能检出。另外,有人报道有意思的是IgG4,女性比男性呈高频率的检出,但也有人追试这一测试却得到不同结果。还有由Westernblot法可大量检出。HSV的特异性蛋白质抗体,含有5-6种的糖蛋白,含[[免疫源性]]的蛋白,HSV-1就有23种,HSV-Ⅱ,也有10-15种,但对此类蛋白的抗体在临床上尚无明确意义。 生殖器疱疹复发感染与抗体水平高低无关。在原发感染后,有高[[滴度]]Ne抗体的患者反比低滴度者更易复发。敏感的放射免疫测定法证实,病毒再激活时偶尔IgG、IgM和IgA抗体升高,在[[唇疱疹]]和生殖器疱疹病人,其HSv IgM抗体出现也不规则,故血清IgM抗体出现或滴度升高不是复发或无症状再激活的可靠判断指标。 ==第五节 发病机理== HSV主要经过皮肤、粘膜或破损处进入人体内,首先在[[表皮]]或[[真皮]]细胞内复制。不论有无临床症状,病毒在局部充分复制后感染[[感觉神经]]或[[自主神经]]未稍。病毒沿[[神经]][[轴索]]进入神经节内的神经细胞中。动物实验发现,从[[皮肤粘膜]][[接种]]HSV到神经节内的神经细胞发现病毒,大约2天时间,可见其感染速度相当快。 HSV-1通常由[[呼吸道]]、[[消化道]]及皮肤粘膜密切接触感染。所以HSV-1常潜伏在[[三叉神经]]根和[[颈上神经节]]内。故临床所见主要是颜面部位的疱疹,HSV-2主要因性行为传播,[[生殖器]]接触而感染,所以HSV-2则常潜伏在[[骶神经节]]内,故临床主要表现为生殖器疱疹。患者[[血清学]]均为阳性,可终生有泌尿生殖道HSV间歇性活动。 感染最初阶段,病毒先在神经节及与之相接触的神经组织内复制,然后通过感觉神经到达其未稍而使与之相关的皮肤、粘膜表面发生皮损。病毒从外周感觉神经扩散到皮肤、粘膜,这一情况,可以解释表皮大面积受感染和远离原发部位新病损发生的原因。[[原发性]]HSV感染病人常有这些特点,而且从远离接种部位的神经组织中发现病毒。初次发病临床症状消退后,在神经内不再分离到[[感染性]]病毒。在细胞表面也检不出病毒蛋白。各种刺激因素,如[[免疫抑制]]、劳累、感染、[[精神创伤]]以及皮肤神经节[[创伤]]等都可引起病毒复活。 原发感染缓解后,神经节中找不到感染的病毒和病毒[[结构蛋白]],潜伏感染神经细胞中的病毒基因组和[[显性感染]]不同,前者HSV的DNA是环状的,在潜伏感染的小鼠神经细胞核内和人的[[三叉神经节]]中检出的RNA转录物中可与编码早期基因ICPO的区域杂交,此RNA是编码ICPO的DNA互补链转录来的。此“反义”RNA可能参与维持神经内潜伏感染但不参与建立潜伏感染,维持潜伏感染的机制不清楚,似乎潜伏感染的细胞仅有HSV蛋白质的部分转录。 ==第六节 [[临床表现]]== 一、症状 HSV感染是一种全身性[[疾病]],病毒经呼吸道、[[口腔]]、生殖器粘膜或破损皮肤进入人体,可潜于人体正常粘膜、[[血液]]、[[唾液]]以及局部感觉神经节和多数器官内,几乎所有的[[内脏]]和粘膜表皮内都可分离到HSV。 原发感染多为隐性,大多无临床症状或呈亚临床表现,仅有少数(约1-10%)可以出现临床症状。主要见于[[免疫功能低下]]婴幼儿或严重[[营养不良]]或有其它感染的儿童,成人罕见。原发感染消退后,病毒可持续潜居体内。正常人中约有半数以上为本病毒的[[携带者]],可通过口、鼻分泌物而成为[[传染源]],由于HSV在人体中不产生永久免疫力,故每当机体抗病能力减退时,如患某种[[发热]]性传染病,[[胃肠功能紊乱]]、[[月经]]、[[妊娠]]、病灶感染、[[过度疲劳]]、情绪环境改变时,体内潜伏的HSV即被激发而发病。 HSV-1主要引起[[口唇疱疹]],[[咽炎]],[[角膜结膜炎]]和[[散发性脑炎]],而HSV-2感染主要引起生殖器疱疹,但在临床上也有相反情况。 HSV感染的[[潜伏期]]为1-45天,平均为6天,HSV-1感染主要发生于口角、[[唇缘]]、[[鼻孔]]等皮肤粘膜交界处,亦可见颜面或[[口唇]],开始局部先有灼痒及轻度紧张感,偶有伴发[[神经痛]]。随即出现[[红斑]],在红斑基础上发生簇集性小丘疹,迅速变为粟粒至绿豆大小的[[水疱]],内容澄清,水疱破裂后出现[[糜烂]]面,数日后干燥[[结痂]]。自觉灼痒,偶有倦怠,不适和轻微发热等[[全身症状]],愈合可遗留暂时性[[色素沉着]]。全病程1-2周左右。 HSV-2感染主要发生于生殖器部位,患部先有烧灼感,很快在红斑的基础上发生成群的小水疱,多见男性包皮、龟头、[[冠状沟]]、[[阴茎]]等处,偶见于[[尿道]];女性常见于阴唇、[[阴蒂]]、[[阴道]]、宫颈等处。水疱可逐渐变成[[脓疱]],约6天左右破溃而形成糜烂或浅的[[溃疡]],自觉疼痛。病人可发生[[尿道炎]],出现[[排尿困难]]。多数人有[[腹股沟淋巴结]]肿大疼痛,有的病人可出现发热、[[肌肉痛]]及[[脑膜炎]]症状。如发于女性宫颈者可形成溃疡[[坏死]],[[阴道分泌物]]增多,可有下腹痛。应注意有无宫颈癌发生。孕期患生殖器疱疹时易致[[流产]]、[[早产]]或[[死胎]],并易使新生儿感染,发生[[新生儿单纯疱疹]]。本病一般经过3周左右可以痊愈,但常有反复发作,一般原[[发疹]]后1-4个月内复发,症状较原发者轻,范围亦小,局限于生殖器部位,有时仅有1-2个疱疹,病程亦短,自发病至愈合8-12天。本病也可伴有生殖器以外部位的感染,如口唇、臂部及[[中枢神经系统]]等。 二、[[体征]] 皮损为红斑基础上可见成群的水疱或脓疱或成糜烂及溃疡。女性患者约90%伴有HSV[[宫颈炎]],宫颈可见发红、糜烂、溃疡,有脓性阴道分泌物。有的患者可有腹股沟淋巴结肿大[[压痛]]或[[体温]]升高。[[皮肤病]]变也可出现在口唇、[[手指]]、臀部、[[大腿]]、手臂,甚至眼部与咽喉。并发脑膜炎或横贯性[[脊髓炎]],一般于发疹后3-12天出现颈项[[强直]]等[[颅内压增高]]的现象。 三、潜伏感染和复发 HSV感染人体后1周左右,血中出现[[中和抗体]],3-4周达高峰,可持续多年,这些抗体能清除病毒和使机体[[康复]],但大多数个体不能彻底消灭病毒,也不能阻止复发,病毒以潜伏状态长期存在宿主体内。不同亚型HSV感染者急性首发生殖器疱疹的临床过程相似,但生殖器病变复发率不同,首发HSV-2感染者约90%,在12个月内会出现一次复发(平均复发4次),而初次感染HSV-1者仅50%出现类似复发(平均复发次数小于1)。不同个体及同一病人一生中生殖器HSV-2感染的复发率变化很大,大多数年复发5-9次,一般在原发疱疹消退后1-4个月内发生,有些患者受到促发因素,如发热、月经、日晒、寒冷、某些[[病毒感染]]等的影响而复发,其特点是每次复发往往发生在同一部位,复发前可有前驱症状如局部[[瘙痒]],发疹前数小时感染部位有灼烧,麻刺感。 复发生殖器疱疹([[GH]])对患者心理影响较大,由于目前尚无预防复发的有效[[疗法]]及可能有诱发生殖器恶变的危险性,故给患者带来心理影响,患者多有[[抑郁]]、恐惧等心理障碍,这又直接影响HSV的复发。我们的治疗经验,只要患者坚持规律治疗,都能治愈。 四、HSV与[[HIV]]感染: HSV常与HIV-1同时感染,并能促进病情发展,引起严重的局部和播散性感染。目前认为HSV是一种调节因素,能激活HIV复制,Heng对6例[[AIDS]]合并[[生殖系统]]HSV皮肤损害患者进行皮肤活检,发现角化细胞和巨噬细胞均有HIV-1和HSV-1杂交后使HIV-1保留其感染性,而无需与CD4分子结合即能进入细胞内。此外HSV-1能刺激潜伏型HIV-1,而增加HIV-1/HSV-1共同感染和在组织中的复制。 ==第七节 组织病理== [[表皮细胞]]发生[[气球样变性]],其中可见有嗜酸性[[包涵体]]。表皮开始为[[网状变性]]形成的多房性水疱,以后聚合为单房性水疱。真皮[[乳头层]]有轻度[[水肿]],有轻重不等炎性细胞[[浸润]]。反应严重时可有严重[[血管炎]]表现。 ==第八节 诊断== HSV感染的诊断要依据病史、临床表现和[[实验室检查]]结果而定。有不洁[[性交]]史,而且在生殖器部位出现皮肤红斑和原发性水疱,易复发等不难诊断。必要时可作疱液[[涂片]],培养、接种、[[免疫荧光检查]]。[[血清免疫]]抗体测定等,均有助于诊断和确定病毒类型。 一、[[细胞学]]方法 对皮损刮片做Wright-Gemsa (Tzanck试验)或Papanicolaou[[染色]],可检出HSV感染特征的[[巨细胞]]包函体,但不能区别HSV感染或[[水痘]]— [[带状疱疹病毒]]感染,敏感性仅为病毒分离的60%。 二、培养法 从水疱底部取材做[[组织培养]]分离病毒,为目前较敏感、最特异的检查方法,需5-10天,因其技术条件要求高,价格昂贵,不能普遍使用。 三、抗体检测 目前最广泛的是HSV-2抗体检测,如[[蛋白印迹法]]也可用gD2作抗原检测HSV-2抗体,具有敏感性,且能区分HSV-1和HSV-2的优点。 四、[[基因诊断]] (一)用PCR分型检测单纯疱疹病毒 PCR是一种敏感性高,特异性强的快速检测方法,[[标本]]中含有1fg HSV-DNA就可以检出,其在HSV感染的诊断研究中发展较快,且分型检测HSV是发展的趋势。 1、标本采集和处理 (1)标本采集 ①[[脑脊液]]:直接[[无菌]]采取患者0.5ml脑脊液标本于无菌[[试管]]送检.如肉眼可见血色,应离心取上清。 ②[[羊水]]及[[婴儿]]血清: 同上,应避免[[溶血]]. ③脑组织: 脑组织[[尸检]]、活检标本,加1ml PBS标本[[缓冲液]]研磨后,待检。 ④眼及皮肤病灶分泌物:用预测(半干)棉拭子直接取患处分泌物,置1ml PBS标本缓冲液中送检。 ⑤生殖器(宫颈、阴道、外阴、阴茎)标本:先用[[消毒]]棉拭子擦去病变部位表面粘液、污垢,再用预潮棉拭子用力擦拭患处分泌物,置1ml PBS标本缓冲液中送检。 (2)标本处理 ①[[预处理]]:所有液体标本均可直接进行模板制备;可以取100μl标本液,离心5000r/ min×5min后,去上清,取沉淀物进行模板制备。 ②模板制备:a: [[蛋白酶]]K消化裂解法:沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液,55℃1h后,煮沸10 min,离心5000 r/ min×5min,收集上清。 b:水煮法:沉淀物加100μl[[蒸馏水]],摇均水煮20 min,离心5000 r/ min×5min收集上清。c:1%Triton X-100裂解法:取采集的标本液100μl,加入1μl Triton X-100,水煮20 min,5000 r/ min×5min,收集上清。d: 5%NP-40裂解法:取采集的标本液100μl,加5μl NP-40,水煮20 min ,5000r/ min×5min收集上清。e:如标本溶血严重经上述裂解处理后,再加等体积酚-[[氯仿]]抽提、冷[[乙醇]]沉淀DNA,加10μlDW溶解待检。 2、PCR[[扩增]] (1)[[引物]]设计。以HSV DNA[[聚合酶]]的高保守区为检测靶序列以确保特异性。设计3个引物,一个上游共同性引物,DNAP5(5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′):二个下游特异性引物,DNAP3-1(5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′ )和DNAP3-2(5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′),可以分别扩增出HSV-1469bpDNA片段(1981~2359)、HSV-2 391bp片段(1561~1953):从二型PCR扩增产物中设计了一个不分型的特异性[[探针]]HSVP3 5‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘)。 (2)PCR实验体系。取模板10μl: DNAP5 0.5(0.2μmol/L):DNAP3-10.5μl (0.2μmol/L):DNAP3-2 0.5μl (0.2μmol/L):4×dNTP 8μl(4×200μmol/L):10×dNTp 8μl(4×200μmol/L);10×缓冲液10μl:DMSO 4μl;加DW65.5μl;[[石蜡油]] 30μl.。 {| class="wikitable" | 水煮(96℃~100℃)7min |- | 加TaqDNA聚合酶1μl;(2.5U) |- | 72℃4 min<br /> ↓<br /> 95℃40s<br /> ↓ 65℃60s →72℃70s<br /> ↓33个循环<br /> 70℃4 min |} 3.扩增产物的检测和分析 (1)[[琼脂糖凝胶电泳]]染色法:取扩增产物20μl加样品缓冲液4μl混匀后,点样于2%[[琼脂糖]]凝胶板,70V电泳15~20min,溴化乙锭(EB)染色5min,于[[紫外灯]]下观察结果在溴酚蓝后面有一条或二条亮红带为阳性结果,HSV-2带在前,HSV-1带在后,无带则为阴性结果。 (2)XhoI[[酶谱]]法:取HSV-1型PCR产物50μl加XhoI50U,37℃1h后,置3%琼脂糖凝胶中,70V电泳15~20min,可产生46bp片段带(引物后面);与正常PCR产物比较,XhoI酶切后的大片段电泳位置前移。 (3)Southern[[印迹法]]:PCR产物20μl经电泳分离后,用变性液处理60min,再用中和液处理90min,转移至[[硝酸]]纤维素膜上:80℃烤膜2 h,42℃预杂交(杂交液中)30min,加入32p标记HSVP3探针后,42℃杂交过夜;次日用1%SDS/ PBs pH7.2, 42℃洗15min, 0.5%SDS/PBS pH7.2, 42℃洗15min; 膜置[[X线]]暗盒内放射性自显影12~15h,显影为阳性, 不显影为阴性。 (二)套式PCR 套式PCR(nested primers-polymerase chain reaction,NP-PCR)是通过“外侧”、“内侧”两对引物,即一对扩增较大DNA片段的“外侧”引物和一对位于扩增产物中再扩增小片段的“内侧”引物,这样两次连续放大可以提高PCR检测的灵敏度,保证产物的特异性。但该方法不能分型,能100%检出HSV-1,50%检出HSV-2,应改进分型检测HSV,更好地在临床应用和基础研究中推广应用。 1、 标本处理: (1)标本采集同上 (2)DNA 制备:①脑脊液:取100μlCSF 水煮15min,加入250μl[[无水乙醇]],放-30℃10min;离心10000g30 min,去上清,30℃干燥后,加入10μl DW; ②脑组织细胞:取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液,56℃作用1h,水煮10min;取上清加入等体积酚一氯仿(V/V),轻摇10 min,离心10000r/min×10min;取水相,加入250μl DW溶解。 2、PCR扩增 (1)引物设计:选择HSV1糖蛋白D基因为检测靶基因。 NP-PCR 的引物和探针序列 {| class="wikitable" | “外”引物 | | |- | BJHSV1.1 | ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA | 19-43 |- | BJHGV1.2 | CATACCGGAACGCACCACACAA | 218-239 |- | “内引物” | | |- | BJHSV1.3 | CCATACCGACCACACCGACGA | 51-79 |- | BJHSV1.4 | CGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA | 166-188 |- | 探针 | | |- | BJHSV-1PRO | TACGAGGAGGAGCTGTATAACAAAGTCTGT | 96-125 |} (2) PCR实验体系和程序: 反应体积为50μl;模板10μl;BJHSV1.10.5μl(0.2pmol/L); BJHSV1.2 0.5μl(0.2pmol/L); 10×缓冲液5μl; 4×dNTp 4μl(4×200mmol/L);DW 27μl; 石蜡油30μl。循环参数为95℃30s;55℃30s; 72℃60s; 循环20次, 取其扩增产物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反应体系中进行套式扩增,先95℃变性2min,循环参数为95℃30s;55℃30s; 72℃60s; 循环30次后,72℃延伸5min;。 (3) 扩增产物分析: ① 琼脂糖凝胶电泳染色法: 取扩增产物10μl点样于2%琼脂糖凝胶中, 70V电泳15-20min,溴化乙锭染色5min,于紫外灯下观察结果,在溴酚兰后面有一条,或二条亮红条带为阳性结果,HSV-2带在前,HSV-1带在后,无带则为阴性结果。 ② Southern印迹法: PCR产物20μl 经电泳分离后,用变性液处理60min,再用中和液处理90min,转移至硝酸纤维素膜上,80℃烤膜2h,42℃预杂交(杂交液中)30min,加入32P标记HSV探针后,42℃杂交过夜,次日用1%SDS/PBs pH7。2,42℃洗15min,0.5%SDS/PBS pH7.2,42℃洗15min;膜置X线暗盒内,[[放射性]]自显影12-15h,,显影为阳性,不显影为阴性。 (三)、[[聚合酶链反应]]—酶谱法(polymerase chain reaction-endonucleasecleavage PCR-EC) 具有经济广泛等特点;不仅能一次性分型检测HSV-1,HSV-2,EBV,CMV四种病毒,而且方法本身快速、方便、无[[放射线]]损伤,易被实验室接受。可检出3个CFU的HSV1,灵敏度高,能检测出[[中枢神经系统感染]]第1dCSF中HSv DNA阳性结果,并可用于药物治疗效果的评价。由于病毒的[[变异性]],会出现酶切点[[突变]]丢失现象,从而造成酶切阴性结果。对此可以通过型特异性探针或序列分析解决。 1. 标本处理 (1) 标本采集,方法同上。 (2) DNA模板制备:每份标本取200μl,按200μg/ml加入蛋白酶k,56℃作用1h; 加入等体积的酚—氯仿(v/v)轻摇10min,离心1000r/min×5min;取水相加入500μl(2.5倍体积)无水乙醇,-20℃过夜沉淀DNA,离心15000r/min×5min,吸去液体,30℃干燥后,加蒸馏水25μl溶解,待检。 2. 引物设计: P1,5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′ P2,5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′ (1)PCR实验体系: 反应体积100μl; 模板10μl ; P1 0.5μl(10pmol/L) ,P20.5μl(10pmol/L); 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L); 10×缓冲液10μl, DMSD 5μl, Dw 65μl, 循环参数为94℃60s;60℃60s; 72℃60s;循环40次℃延伸4min。 (2)扩增产物检测与酶切分型. ①第一步电泳鉴定: 取10μlPCR产物加4μl样品缓冲液,加入2%琼脂糖凝胶板,70V电泳(5-20min)加EB染色5min后,紫外灯下观察,可初步鉴定扩增产物大小。 ②酶切分析:分别取20μlPCR产物于2个Eppendorf管中,加入50μl无水乙醇,-20℃沉淀DNA,再分别用20μlSmal和BamHI反应缓冲液溶解,加入SmaI或BamHi50U于相应Eppendorf 管内,37℃作用1h。 ③第二步电泳分型,取10μlPCR酶切物加4μl样品缓冲液,加到2%琼脂糖凝胶中,70V电泳,15-20min后,EB染色5min,与同步加入未酶切的PCR产物相对照。 紫外灯下观察,结果如下: PCR-EC法检测四种病毒结果 {| class="wikitable" | [[病毒型]]号 | 靶片段 | SmaI | BamHI |- | HSV1 | 518bp | 476bp+42bp | |- | HSV2 | 518bp | — | 225+293bp |- | EBV | 524bp | 100bp+424bp | 277bp+247bp |- | CMV | 589bp | 不需酶切,第一步电泳就可以区分 | |} (四)用RT-PCR检测单纯疱疹病毒 RNA的聚合酶链反应(RNA-PCR),可能通过检测HSV不同期的RNA,这不仅可诊断HSV感染,而且有利于HSV的潜伏期感染机制的深入研究。 RT-PCR是以RNA为模板经[[逆转录]]反应(RT)产生cDNA,再以cDNA为模板进行PCR扩增以达到检测目的。因此,RNA-PCR也可称为RT-PCR。 1、标本处理: 组织块细胞总RNA提取,取100mg组织标本,加1ml[[硫氰酸]]胍变性液,于[[匀浆器]]中,室温研磨均匀后,移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc,1ml水[[饱和]]酚和0.2ml氯仿一异[[戊醇]]混匀,用力振摇10s, 置冰浴15min。10000g4℃,离心20min,取上清水相(上层DNA、下层DNA和[[变性蛋白]]质)加入等体积[[异丙醇]]置-20℃1h,沉淀RNA。离心 15000r/min×10min,弃上清, RNA重新用0.3ml硫氰酸胍变性液溶解,再加0.3ml异丙醇沉淀,-20℃1h, 沉淀RNA. 离心15000r/min×10min,去上清, 沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次, [[真空干燥]]。.加10μl TE缓冲液(pH7.4)溶解,[[低温]]保存备用.临用前冰浴溶解。 2、PCR扩增: (1) 引物设计: 选择HSV-1ICPO基因(极早期)为检测靶基因.设计2个引物, P1 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′ P2 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以扩增ICPO 中266bp序列。 1个探针:5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。 (2)PCR实验体系:总反应体积为50μl,模板10μl (0.25-1.0μg)P1 1μl (20pmol/L);P2 1μl (20pmol/L);4×dNTP 4μl(200μmol/L); 10×缓冲液5μl; AMV([[逆转录酶]])2μl(50U); DW 26μl; 循环参数, 94℃变性2min后 94℃50s,60℃60,72℃60s,循环40次后72℃延伸5min。 3、扩增产物的鉴定: (1)琼脂糖凝胶电泳染色法:取10μl PCR扩增产物加4μl 样品缓冲液,混匀后加样2%琼脂糖凝胶板,70V电泳15-20min,EB染色5min。紫外灯下观察扩增条带。 (2)Southern印迹杂交法:用32P标记的特异性探针检测PCR产物,方法同上。 总之,在HSV[[感染性疾病]]的[[临床诊断]]中,PCR能对前病毒或潜伏期低复制的HSV特异性靶DNA片段进行扩增检测,远较DNA探针敏感,并能在血清中抗体出现前就可以检出。因此,PCR无论是作为基础研究手段,还是作为临床检验诊断方法,均具有广阔的前景。 五、病理[[组织学]]诊断 [[细胞内水肿]],[[基底层]]形成大水疱,病灶周围有多核巨细胞浸润,特别是[[多核]][[白细胞]]与淋巴细胞充斥于病灶中间。 ==第九节 鉴别诊断== 主要与[[硬下疳]],[[软下疳]]鉴别:硬下疳为单个质硬的溃疡,无疼痛感,无复发史,实验检查[[USR]](+)或[[RPR]](+),[[梅毒螺旋体]]可见。软下疳为质软的溃疡,局部虽有疼痛感但无复发史,实验检查链杆菌阳性。 其他生殖器部位皮肤病如接触性[[带状疱疹]]、[[白塞病]]。[[脓疱病]]有时与生殖器疱疹相似,可以从病史及检查方面相区别。 ==第十节 治疗== 本病有自限性,约1-2周即可自愈。治疗的目的是防止下次复发。本病目前尚无特效药物,治疗原则为缩短病程,防止[[继发感染]],减少复发。 1.局部疗法:原则为干燥、收敛、保护患部,防止继发感染。可外涂2%[[龙胆紫溶液]],或选用10%次[[没食子酸]]铋(代马妥dermatol)、[[氧化锌油]]膏或泥膏、[[紫草]][[生地榆]]油膏、0.5%新霉素软膏、或0.25%~0.1%[[疱疹净]](IDU)软膏、5%疱疹净[[二甲基亚砜]]溶液(用于皮肤疱疹)等。对颜面部者亦可用10%[[醋酸]]铝或锌铜合剂。 2.全身治疗:治疗原则其一使感染的HSV不能[[活化]],甚至消灭病毒;其二调节免疫,防止再发,可用[[阿昔洛韦]]静滴或口服,[[丽珠威]]口服,干扰素肌注,[[白细胞介素]]Ⅱ肌注。我们在治疗复发性生殖器疱疹时,使用四医大[[生物技术]]中心产的干扰素300万单位肌注,每日一次,10次为一疗程,共三个疗程,适当配合使用白细胞介素Ⅱ或利百或[[灵杆菌素]],95%的病人不复发。 下面介绍别人治疗疱疹方法供参考: '''一、 抗HSV药物''' (一)无环乌苷是公认的有效药物: 1.原发和初发感染:ACV200mg,每日5次,连服7天;或ACv 5mg/kg,按体重[[静注]],8小时一次,连续5-7天。 2.复发感染时,ACV 200mg,每日5次,连服5天,或ACV800mg,每日2次,连服5天;若在刚开始出现前驱症状时或在损害出现后的2天内即开始治疗,则对部分患者可能有效 3.复发频繁时:ACV200mg,每日3次,可连续服用6-12个月。在经常复发的患者中(每年&gt;6次),每日治疗至少可以减少75%的复发次数,在接受长达3年治疗的人群,已确定是安全有效的。从接受治疗的人群中已分离到耐ACV的HSV株,但[[免疫功能]]正常者未见治疗失败者。治疗1年后应停药,以便重新评价患者的复发率。 4.免疫受抑制患者:首发或复发的急性患者:静注ACV(5mg/kg/8h)或口服ACV400mg×4次/日,共7-10天;抑制复发:每天静注ACV(5mg/kg/8h)或口服ACV(400mg×3-5次/天),可预防复发。 5.HSV[[直肠炎]],ACV 400mg,每日5次,可缩短病程。免疫受抑制或重症者可静注ACV5mg/kg/8h。 6.新生儿HSV:现有资料认为,不应该常规应用ACV治疗通过产道感染的无症状婴儿,治疗仅限于有HSV临床表现及产后[[病毒培养]]阳性的患儿。所有新生儿HSV感染者应接受ACV或[[阿糖腺苷]]治疗。常采用ACV300mg/kg/d,阿糖腺苷30mg/kg/d,[[静脉注射]]共10-14天。 7.合并HIV感染:患者需口服ACV间歇或每日抑制治疗。对合并HIV感染者增加ACV剂量是十分有益的。 ACV400mg,口服,每日-5次,治疗有效,应持续用药直至临床症状消失;对重症者,应用ACV[[静脉]]给药,对可疑或已证实的ACV[[耐药]]株引起的重症患者,最佳方案可能是:ACV400mg/kg,静脉注射,每8小时一次,直至临床痊愈。 HIV感染者中的皮肤损伤粘膜HSV感染时大剂量ACV治疗无反应者日益增多。大剂量ACV对部分患者有助于损伤的愈合,但不能阻止另外一些患者的病情进展。对复发频繁者长期服用ACV不能制止继续排毒,因此,仍可对性伴感染,此时若改用作用机理不同的[[抗病毒药物]]如磷甲酸和阿糖腺苷等可能有效。 ACV的抗病毒机理是它很容易被HSV编码的胸苷激酶[[磷酸]]化,形成ACV-MP,再被细胞[[激酶]]作用而形成ACV-[[TP]]。ACV-TP与dGTP竞争而[[抑制病毒]]DNA合成。 ACV全身应用治疗首次临床发作或作为抑制治疗药物时,可使疱疹发作的症状和体征得到控制。然而,该药既不能根除潜伏病毒感染,也不能影响以后发作的次数和严重性。该药局部治疗的效果比口服差,故不提倡局部用药。 ACV可缩短生殖器疱疹病程,加速愈合及缓解症状,长期应用可减少复发,曾有人对11000例免疫正常的GH连续治疗5年,在此期间复发率明显降低。 但是长期口服ACV不能清除骶神经节的潜伏病毒,停药后生殖器疱疹仍可复发,对ACV有[[耐药性]]的[[病毒株]]越来越多,几乎所有耐药性都发生于曾经进行多个病程治疗的免疫受损害者。 ACV静脉应用的主要[[副作用]]是由于药物在[[肾实质]]内结晶而引起的暂时性[[肾功能不全]]。若缓慢给药一小时以上或大量饮水则可避免此副作用。 (二)、[[病毒唑]]([[三氮唑核苷]],Ribavin RBV):抑制病毒多种DNA及RNA复制,合成。 用量:原发GH及AIDS合并HSV感染,15mg/kg/d,肌注;复发GH,0.4g,口服,每日4次,3天后改为0.4g,每日2次,共5天,疗效肯定,用于耐药病毒株。 (三)、磷甲酸(TrisodiumPhosphonoformate,PFA);选择性抑制疱疹病毒诱导的DNA依赖的DNA聚合酶,主要用于耐ACV病毒株的感染。 用量:40-60mg/kg/d,静脉注射,每8小时1次,连用4次,可用于AIDS合并HSV感染。外用0.3%-1%PFA霜。副使用有肾[[毒性]]及钙[[磷代谢紊乱]]。 (四)、双羟丙氧甲基乌苷([[更昔洛韦]],Ganciclovir,DNPG):是ACV的[[衍生物]],通过抑制病毒DNA复制,导致RNA合成受阻,感染细胞DNA多聚酶是作用的靶部位。 用量:5-10mg/kg/d,分3次静注,连续14天,副作用有[[造血系统]]抑制及[[肝损害]]。 (五)、氟阿糖碘[[胞苷]](FIAC):对HSV-1和HSV-2有同样作用,选择性作用于被病毒感染的细胞,其[[代谢]]产物5-碘[[尿嘧啶]]、5-[[甲尿嘧啶]]均有抗病毒作用。阿糖腺苷磷酸抑制病毒DNA合成,有[[广谱]]抗病毒活性,副使用少,不能防止潜伏感染的建立,但防止病毒进入中枢神经系统有一定保护作用。抗HSV单克隆抗体局部外用,对GH有治疗作用,国外有人报道治疗HSV-2总有效率92.6%,基本治愈率44.1%。 (六)、[[消炎痛]](Indomethacin):作用为抑制[[前列腺素]]合成,有助于减少GH的复发,促进conA及PHA([[植物血凝素]])刺激所发生的细胞增殖作用,加强NK细胞的杀伤能力,可用于复发GH的治疗,用量:25mg口服,每日3次。 (七)、[[聚肌胞]](PolyZIC):是人工合成的[[干扰素诱导剂]],能刺激[[吞噬作用]],增强抗体形成,对[[免疫系统]]起调节使用。用量2mg,肌注,2-3次/周。 '''二、对妊娠GH的处理''' 对孕妇使用[[无环鸟苷]]的安全性尚未肯定,但研究发现,用ACV的孕妇畸胎发生率与正常人相比,并无增高,但ACV对妊娠及[[胎儿]]的危险性尚未得出可靠结论。 对威胁母亲生命的HSV感染,如[[脑炎]],[[肺炎]]及[[肝炎]],应采用ACV静脉用药,但无威胁生命的HSV感染,不必全身用ACV治疗。 依照美国[[传染病]]学会建议,对[[妊娠期]]反复发作的GH处理方案如下: (一)[[分娩]]时如无活动性生殖器损害,则无需剖腹产; (二) 妊娠未3个月,症状性复发是短暂的,只要分娩时无活动性损害,可经阴道分娩。 (三)临产时有活动GH者,可作如下处理:①[[羊膜]]未破,孕妇不发热,胎儿尚未成熟,应延缓分娩;②如系足月妊娠,羊水已破,胎儿肺已成熟,应行剖腹产。 ==第十一节 预防与护理== (一)避免不洁性交及不正当的性关系,活动性生殖器疮疹患者绝对禁止与任何人发生性关系; (二)治疗期间禁行房事,必要时配偶亦要进行检查; (三)对局部损害的护理,应注意保持清洁和干燥,防止继发感染。 (四)治愈后或有复发者,要注意预防[[感冒]],受凉,劳累等诱发因素,以减少复发。 目前尚无特异性预防方法,动物实验表明,接种HSV[[死疫苗]]或[[减毒活疫苗]],均有[[免疫效果]],因此病毒与某些[[癌症]]的关系密切,故不作常规预防使用。最近用[[纯化]]的疱疹病毒[[包膜糖蛋白]]作[[疫苗]],可避免疱疹病毒DNA的致癌危险性。 ACV也有预防作用。阴茎套可能减少疾病的传播,尤其是在无症状排毒期,但出现生殖器损害时,使用阴茎套也不能避免传播。 ==参看== *[[生殖器疱疹]] {{Hierarchy footer}} {{基因诊断与性传播疾病图书专题}}
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