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医学免疫学/细胞免疫功能的检测
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{{Hierarchy header}} [[细胞免疫]](CMⅠ)是由多种[[细胞]]相互作用的结果。[[免疫细胞]]间相互作用导致多种[[细胞因子]]的释放。因此细胞功能测定不仅涉及T细胞的数量和功能与包括各类因子活性测定,因此评价机体的细胞免疫功能不仅程序复杂,且很难标准化 == 一、迟发型[[过敏反应]]的体外检测方法== [[皮肤]]试验和接触性[[过敏]]的诱发是检测迟发型过敏反应(DTH)的两种常用方法。皮肤试验中诱发对曾经使病人[[致敏]]的[[抗原]]的再次应答,而接触性过敏是测试受者对从未接触过的物质发生致敏的能力。 1.皮肤试验 用皮肤试验诊断DTH,常用的抗原有[[结核菌纯蛋白衍生物]](PPD)、[[腮腺炎病毒]]、念珠菌素等,在人类试验时在[[前臂]][[皮内注射]]少量[[可溶性抗原]],24~48小后,测量[[红肿]][[硬结]]的大小,硬结直径大于10mm即被看作为阳性。表明受试者对该[[病原菌]]有了一定的细胞免疫能力,若皮试无反应,可用更高浓度的抗原重复试验,若仍无反应即为阴性,需排除皮试技术误差,也可能受试者从未接触过此抗原,也可能由于细胞免疫功能缺损,或由于细胞免疫功能缺损,或由于严重[[感染]]([[麻疹]]、慢性[[播散性结核]])造成的无反应性。 2.接触性过敏常应用[[低分子量]][[化合物]]如[[二硝基氯苯]](DNCB)诱生接触性过敏。化合物与皮肤[[蛋白质]]结合而导至DTH反应。在[[动物试验]]时,初次皮肤上涂抹DNCB后间隔7~10天再激发刺激,则皮肤出现即为阳性。此试验人类已不使用。 == 二、细胞免疫的体外检测方法== 体外检测[[淋巴细胞]]的数量和功能,最易采集的是[[血标本]],首先需分离或[[纯化]]淋巴细胞,一般使用萄[[聚糖]]-[[泛影葡胺]]配成[[比重]]为1.077的淋巴细胞分层液,当将[[血液]]重叠于淋巴细胞分层液之上离心时,由于[[红细胞]](1.092)、[[多形核白细胞]](1.090)、淋巴细胞(1.070)的比重不同而相互分开。淋巴细胞和[[单核细胞]]在[[血浆]]和分层液交界处形成一薄层。仔细分出这一薄层的细胞,其中淋巴细胞占80%,单核细胞占20%,淋巴细胞中T细胞占80%,B细胞占4%~10%,其作为非DT、非B细胞。 '''1.T[[细胞计数]]''' (1)E花环法:人类T[[细胞表面]]有SRBC[[受体]](CD2)能与SRBC结合形成[[玫瑰花]]环样结构,将经分层液分离现的RBM悬液与SRBC在含有[[血清]]的平衡盐水中混合,经37℃培养5~10分钟放4℃过夜,取细胞悬计数,外周[[血淋]]巴细胞中约70%~80%淋巴细胞结成花环即为T细胞。目前此方法已用来分离T细胞,而不用做T细胞计数。 (2)用[[单克隆抗体]]计数T细胞:将人的PBM分成三等份,分别用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的单克隆抗体作第一[[抗体]]与细胞结合,再用FITC标记的兔抗小鼠[[IgG]]抗体作第二抗体进行间接免疫荧光[[染色]],在[[荧光显微镜]]下或[[流式细胞仪]]检测结果,在PBM中被CD3抗体染上荧光的细胞称为CD3+细胞即总T细胞。正常人在PBM中T细胞占70%~80%。正常人的CD4+细胞和CD8+细胞之和应与CD3+细胞数一致。CD4+细胞与CD8+细胞的比值正常人约为2/1而[[艾滋病]]患者则比值小于1.7。 '''2.T细胞[[活化]]试验''' T细胞能被非特异的物质称为[[有丝分裂]]原所激活而向[[淋巴母细胞]]转化。T细胞转化过程可伴随有[[DNA]]、[[RNA]]、蛋白质的合成增加,最图导致细胞分裂。在[[光学显微镜]]下可计数转化后的淋巴细胞数,也可用氚标记的[[胸腺嘧啶核苷]](3HTdR)掺入正在分裂的淋巴细胞,用液闪测定仪检查掺入正在分裂的淋巴细胞,用液测量仪检查掺入的3H-TdR的多少确定淋巴细胞转化率。最近有一种不用[[同位素]],又可用仪器测量的淋巴细胞[[增殖]]反应的检查法,称为MTT检测法,MTT是一种甲氮唑盐,它是细胞[[线粒体]][[脱氢酶]]的[[底物]],细胞内的酶可将MTT分解产生蓝黑色甲(fromazan)产物。该产物的多少与活性细胞数[[正相关]]。结果可用酶标检测仪(595mm)测量汇丰银行密度,做为MTT法的检查指标。此法的结果与3H-TdR掺入法平行,并能反应试验中的活细胞数(表20-3)。 表20-3 淋巴细胞增殖反应的刺激物 {| class="wikitable" |- | | [[分裂原]] | | T细胞 | | B细胞 |- | | [[植物血凝素]](PHA) | | + | | - |- | | [[刀豆]][[蛋白]]A(ConA) | | + | | - |- | | 美洲[[商陆]](PWM) | | + | | + |- | | [[葡萄球菌]]蛋白A(SPA) | | ±﹡ | | + |- | | [[副伤寒]]杆B(SPB) | | ± | | + |} 注: PWH主要是T细胞分裂原,也可通过刺激T[[细胞分泌]]可溶性因子诱导B细胞增殖[[分化]]; ﹡SPA诱导B细胞分裂不需要T细胞协助,但诱导B细胞激活抗体[[分泌细胞]]需要T细胞协助 '''3.[[细胞毒试验]]''' [[TC]]细胞、NK细胞、[[LAK细胞]]、TIL细胞对其[[靶细胞]]有直接的[[细胞毒]](杀伤)作用。常用的栓测细胞毒效应的方法是51[[Cr]]-[[Na]]2Cro4盐水溶液与靶细胞胞混合,于37℃培养1小时左右,51Cr即可进入靶细胞,与[[胞浆]]蛋白结合,洗去游离的51Cr后,即可得到51Cr标记的靶细胞,将待检[[细胞毒性]]的细胞与51Cr标记的靶细胞混合(比例约为50:1或100:1)靶细胞被杀伤越多,释放到[[上清液]]中的液游离的51Cr越多,且不能被其他细胞吸收。用γ[[射线]]测量仪检测上清液中的cpm值,即可计算出待检细胞杀伤活性的高低。 细胞毒试验检测Tc细胞效应功能是否健全,及经IgG介导的ADCC效应,或NK细胞在[[抗肿瘤免疫]]中的作用是有意义的。 '''4.混合淋巴细胞的反应(MIR)''' 是体外研究T细胞的较好的方法,双向MLR常被用来筛选[[骨髓移植]]的[[供体]]。来自不同供体的淋巴细胞分别与病人的淋巴细胞[[混合培养]]4~5天,在最后8小时掺入51TdR掺入法测T细胞的反应性。或用细胞毒法观察受刺激的T细胞与活的靶细胞混合(靶细胞来自与刺激细胞相同的个体)如果T细胞受刺激后产生了细胞毒T细胞,可杀死活的细胞,根据靶细胞释放51Cr的多少算出T[[细胞移动]][[抑制因子]])和LIF([[白细胞移动抑制因子]])来评估细胞免疫功能。近年来应用测定IL-2的[[免疫]]酶技术,操作简单,并能定量以取代了MIF和LIF的测定。单个核细胞与分裂原一起培养24小时,然后测定[[清液]]中的IL-2活性。在细胞免疫功能缺损时,特别是[[AIDS]]病人,IL-2分泌明显降低。而有些[[疾病]],如[[多发性硬化]]、[[类风湿关节炎]]、[[移植排斥]]反应等病人体内血清中IL-2水平升高,表明病人T细胞活性增高。发生移植排斥反应的病人尿中IL-2也可升高。 也可用[[酶联免疫吸附试验]]测定各种体液中活化的T细胞脱落的IL-2受体(CD25),一般来说IL-2的水平和IL-2受体水平是平行的,IL-2和IL-2受体的检测可用于对某些疾病的监测,如移杆排斥、[[自身免疫病]]以及接受[[免疫抑制治疗]]的病人。 对体外培养的细胞进行细胞因子产生能力检测是检查[[细胞培养]]上清液中细胞因子的[[生物]]活性或[[抗原性]]。现已可用[[核酸]]杂交技术,即从组织中或细胞中提取RNA,与同位素或[[酶标记]]的该种细胞因子的cDNA[[探针]]作[[分子杂交]]试验,即印迹(dot blotting)或Northern印迹,若查出有某种因子的mRNA存在,即说明该细胞在所处培养条件下有产生某种细胞因子的能力。 {{Hierarchy footer}} {{医学免疫学图书专题}}
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