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[[双向凝胶电泳]]的原理是第一向基于[[蛋白质]]的[[等电点]]不同用[[等电聚焦]]分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂[[蛋白]]混合物中的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面改进已成为研究[[蛋白质组]]的最有使用价值的核心方法。

分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个[[基因]]可表达的蛋白数目相比还是太少了。80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了载体[[两性电解质]]阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。由于可以建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有[[垂直板]]电泳和水平超薄[[胶电泳]]两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。

其中灵敏度较高的[[银染色]]法可检测到4ng蛋白，最灵敏的还是用[[同位素标记]]，20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。用图像扫描仪、[[莱赛]]密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即所谓“参考胶图谱”。蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析，确定它们是已知还是未知蛋白。现在的分级分析法是先做快速的[[氨基酸]]组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在[[电泳胶]]板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。有文献报道，N末端4个[[残基]]序列的数据就可以给出很多的信息而得到相当准确的结果。如再结合C末端序列，判断结果的准确性会更高。对分离得到的蛋白质作进一步的确切鉴定需要有足够数量的纯蛋白，电泳时蛋白质已经过了高度[[纯化]]。现在一块胶板可允许上到高达mg数量级的样品，因此每个分离的蛋白斑点可有μg数量的蛋白，这样使本来是微量的蛋白也可希冀被鉴定。

蛋白质的[[翻译后修饰]]和加工，是指在[[肽]]链合成完成后进行的化学反应，如[[磷酸]]化、[[羟基]]化、[[糖基化]]、[[二硫键]]形成，以及最近发现的蛋白质自[[剪接]]等等，可能有一百种以上。翻译后修饰和加工对蛋白质的正常[[生理]]功能是必需的，它们的变化往往和[[疾病]]的发生有关。用双向凝胶电泳可以进行翻译后修饰的研究，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化。双向凝胶电泳中常可发现的蛋白质拖曳现象，很可能是一个蛋白的不同翻译后修饰产物所造成的。拖曳图像变化在疾病诊断上可能提供重要的信息。

双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是：(1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的[[调节蛋白]]。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望的还是把介质辅助的[[激光]]解吸/离子化质谱用到PVDF膜上，但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。(2)极酸或极碱蛋白的分离。(3)极大（＞200kD）或极小（＜10kD＝蛋白的分离。(4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白。(5)得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切需要自动[[二维电泳]]仪的出现。

[[分类:生物学]]