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医学遗传学/基因探针
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{{Hierarchy header}} [[基因探针]](probe)就是一段与目的[[基因]]或[[DNA]]互补的特异[[核苷酸序列]],它可以包括整个基因,也可以仅仅是/基因的一部分;可以是DNA本身,也可以是由之[[转录]]而来的[[RNA]]。 '''1.[[探针]]的来源''' DNA探针根据其来源有3种:一种来自[[基因组]]中有关的基因本身,称为[[基因组探针]](genomic probe);另一种是从相应的基因转录获得了mRNA,再通过[[逆转录]]得到的探针,称为cDNa 探针(cDNa probe)。与基因组探针不同的是,cDNA探针不含有[[内含子]]序列。此外,还可在体外人工合成[[碱基]]数不多的与基因序列互补的DNA片段,称为[[寡核苷酸探针]]。 '''2.探针的制备''' 进行[[分子]][[突变]]需要大量的探针拷贝,后者一般是通过[[分子克隆]](molecular cloning)获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、[[细胞]]或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进,应先制备[[基因组文库]],即把基因组DNA打断,或用限制性酶作不完全水解,得到许多大小不等的随机片段,将这些片段体外[[重组]]到运载体([[噬菌体]]、[[质粒]]等)中去,再将后者[[转染]]适当的[[宿主]]细胞如[[大肠]]肝菌,这时在[[固体培养基]]上可以得到许多携带有不同DNA片段的克隆噬菌斑,通过[[原位杂交]],从中可筛出含有目的基因片段的克隆,然后通过细胞[[扩增]],制备出大量的探针。 为了制备cDNA 探针,首先需分离[[纯化]]相应mRNA,这从含有大量mRNA的组织、细胞中比较容易做到,如从[[造血细胞]]中制备α或β[[珠蛋白]]mRNA。有了mRNA作模板后,在[[逆转录酶]]的作用下,就可以合成与之互补的DNA(即cDNA),cDNA与待测基因的[[编码区]]有完全相同的[[碱基顺序]],但内含子已在加工过程中切除。 寡核苷酸探针是人工合成的,与已知基因DNA互补的,长度可从十几到几十个[[核苷酸]]的片段。如仅知[[蛋白质]]的[[氨基酸]]顺序量,也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列,并用[[化学]]方法合成。 '''3.探针的标记''' 为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交,有必要对探针加以标记,以便在结合部位获得可识别的信号,通常采用[[放射性同位素]]32P标记探针的某种核苷酸α[[磷酸基]]。但近年来已发展了一些用非同位素如[[生物素]]、[[地高辛]][[配体]]等作为[[标记物]]的方法。但都不及[[同位素]]敏感。非同位素标记的优点是保存时间较长,而且避免了同位素的污染。最常用的探针标记法是[[缺口平移]]法(nicktranslation),其原理如图13-1。首先用适当浓度的DNA酶Ⅰ(DNAseⅠ)在探针DNA双链上造成缺口,然后再借助于DNA[[聚合酶]]Ⅰ(DNa poly merasⅠ)的5’→3’的外切[[酶活性]],切去带有5’[[磷酸]]的核苷酸;同时又利用该酶的5’→3’聚酶活性,使32P标记的互补核苷酸补入缺口,DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用,使缺口不断向3’的方向移动,同时DNA链上的核苷酸不断为32P标记的核苷酸所取代。 {{图片|gv213mlr.jpg|缺口平移标记法粗线示标记部分}} 图13-1 缺口平移标记法粗线示标记部分 探针的标记也可以采用随机[[引物]]法,即向变性的探针溶液加入6个核苷酸的随机DNA小片段,作为引物,当后者与[[单链DNA]]互补结合后,按碱基互补原则不断在其3’OH端添加[[同位素标记]]的[[单核苷酸]],这样也可以获得比[[放射性]]很高的DNA探针。 ==参看== *[[基因探针]] {{Hierarchy footer}} {{医学遗传学基础图书专题}}
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