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医学免疫学/分子生物学技术在免疫学诊断中的应用
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{{Hierarchy header}} == 一、BCR和TCR[[基因]]重排检测== 对[[血细胞]]恶性变如[[白血病]]、[[淋巴瘤]]等的诊断,长期以来多应用[[细胞形态学]]检查和[[免疫细胞]][[表型]]分析。由于这些方法在特异性和敏感性上的限制,对于丢失了[[细胞表面]]标志,或[[分化]]较好难以和正常[[细胞]]区别。也可能由于恶性细胞数量少,混在大量正常细胞中难以查出。近年来由于[[分子]][[生物学]]技术的广泛应用,且由于获得了Ig片段的特异基因克隆及TCR各链的基因克隆,在此基础上发展了应用Ig基因重排作为B细胞的特异标记,诊断B细胞来源的白血病的和应用TCR基因重排为T细胞特异标志诊断T细胞恶性变引起的白血病,从而将白血病的[[细胞学]]分类法提高到基因水平分析,建立了[[免疫]][[基因型]]诊断的新方法,大大提高了诊断的敏感性和特异性。该方法不但可以确定细胞来源、分化程度,且由于[[DNA]]分析的高度敏感性而能查出[[显微镜]]不能看到的微小变化,从而能监测治疗效果,发现微量残留病变细胞。 该方法首先要从待检的细胞中分离出总DNA。在非T、非B细胞的Ig和TCR基因不发生重排称为[[胚基]]因(germ line)。而T和B细胞在分化早期即有TCR和Ig基因重排,重排后的Ig和TCR片段,转移至[[硝酸纤维膜]]或[[尼龙]]膜上,然后用[[同位素]]或[[酶标记]]的Ig血病细胞进行分类鉴定,若有Ig基因重排说明恶性细胞来源于B细胞,若有TCR基因发生重排,则为T细胞来源的。如果既无Ig基因重排,又无TCR基因重排的[[淋巴细胞]]则属非T、非B细胞来源的瘤细胞。 == 二、[[限制酶切]]片段长度[[多态性]][[组织配型]]法== 迄今,一直是[[血清学]]和细胞学方法进行HLA[[抗原]]结构分析,最近已开始应用分子生物学基因克隆技术进行HLA定型。由于人们已常握了HLA共同和特异的抗原的[[核苷酸序列]],才有可能用此新方法进行组织配型检验。 限制酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)组织配型技术的原理是目前已掌握了编码HLA抗原的核苷酸序列,包括各[[等位基因]]共有的和专有的序列。HLA-A、-B、-C[[位点]]的Ⅰ类[[重链]]基因的核苷酸序列有高度[[同源性]],由这些基因片段克隆可得HLAⅠ类专用的[[探针]],因为检测HLAⅠ[[类抗原]]序列的标志,目前也已得到Ⅱ类抗原特异的探针。由于HLA等位基因的多态性是表现在其核苷酸序列的差异上,由这些基因中克隆出的特异DNA片段,就可检测这些基因的差别。由于核苷酸序列不同,被[[限制性内切酶]]作用部位(切点)也不同,这种酶切点只有4~6个[[核苷酸]]长度。因此来源于不同HLA[[单倍型]]的DNA可被一种[[内切酶]]切成不同长度的片段。在实际工作中,从细胞中提取[[基因组]]DNA(genomic DNA)的多态性比实际HLA-Ⅱ类抗原的多态性还要复杂,因为基因的[[内含子]](不[[转录基因]])序列不同,和[[外显子]]([[转录]]并翻译成[[蛋白质]])序列差别均在酶切后的细胞总DNA中。 RFLP组织配型检测主要包括4个步聚(印迹):①提取细胞总DNA,用限制性内切酶[[消化]];②[[凝胶电泳]];③将[[凝胶]]中分离好的DNA片段转移至尼龙膜上;④经变性处理后用[[同位素标记]]的探针进行[[分子杂交]]。经[[放射自显影]],得到显影带(bands)。即可得知[[分子量]]大小不同的DNA片段(图20-9)。 {{图片|guzu0qql.jpg|用RFLP进行组织定型比较三个[[标本]]的组织定型}} 图20-9用RFLP进行组织定型比较三个标本的组织定型 RFLP组织配型实验是用于血清学或细胞学检测失败的样品,如HLA抗原不表达([[裸细胞]])细胞脆性大而破碎,[[淋巴细胞减少]]没有足够的样品时。由于分子[[生物学方法]]采样少、特异、敏感的优点可弥补常规方法的不足。此外,RFLP组织配型法还可查出DNA[[变异]]及[[基因重组]]的情况,而血清学方法则不能。PFLP组织配型为[[器官移植]]、[[骨髓移植]]选择适宜的[[供体]],用比较供体,[[受体]]限制酶切片段的长度的差异。两者的RFLP越接近。差别越小,[[移植]]效果越好,近年来发展的PCR-RFLP以其简单、敏感、可靠、价廉且无需同位素等优点,已取代了RELP法。 {{Hierarchy footer}} {{医学免疫学图书专题}}
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