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临床生物化学/核酸扩增技术
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{{Hierarchy header}} 通过[[大肠埃希菌]]繁殖而[[增殖]][[重组质粒]],也是[[扩增]][[核酸]]的手段。但在[[试管]]中有效扩增[[DNA]]的方法,是在90年代才开展起来的[[多聚酶]]链反应(polymerase chain reaction,PCR)新技术。由于PCR灵敏度高、特异性好、操作方便,在我国发展很快。目前,PCR技术结合[[分子]][[生物学]]实验技术(如[[逆转录]]反应杂交技术等)开发了许多PCR新技术(reverse transcriptase PCR;PCR-single strandconformation polymorphism,PCR-SSCP;巢式PCR(二次PCR);热启动PCR等)。RT-PCR用于[[RNA]]分析;PCR-SSCP分辨率高,可用于[[点突变]]分析;二次PCR特异性好,灵敏度高;热启动PCR可提高特异性。 PCR技术原理是在了解DNA[[一级结构]]基础上设计[[引物]](primer或sense,人工合成),DNA多聚酶可识别并结合引物,以[[单链DNA]]为模板,dNTP为[[底物]],合成其互补链。通过反复变性,反复合成互补链的过程,达到DNA扩增的目的。人的DNA[[扩增引物]]长度多为20个核甘酸。(图18-7) {{图片|gor4vvzo.jpg|PCR技术原理}} 图18-7 PCR技术原理 PCR反应:DNA样品0.1-1μg,引物1,2各25-100pmol,dNTP各200μmol/L,Tris-HCl(pH8.3)10mmol/L,KCl 50mmol/L,MgCl<sub>2</sub>1.5mmol/L,gelatin([[明胶]])0.01%,Taq多聚酶2.5-5U,矿物油一滴。93℃7分钟→50-55℃2分钟→70-72℃3-1.5分钟→93℃2分钟。 {{图片|gor4vrys.jpg|}} 将反应物和Marker点样于[[凝胶]]一起电泳,紫外光下观察结果,拍照保存结果。反应物也可用于印迹(杂交)实验、多态分析、[[探针]]制备等。 注意事项:①DNA样品纯度高,Taq酶(和Klenow酶)有[[逆转录酶]]活性,DNA和RNA不能混在一起。②设计的引物分子内(特别3′端)和引物,1,2分子间不形成双链。选择性好,不增幅目的DNA以外区域的DNA。引物的G+C含量为40%-60%。③dNTP浓度过高易使Taq酶合成错误,一般在200μmol/L,有人建议40-50μmol/L。④KCl>75mmol/L对酶有抑制作用。[[Mg]]<sup>2+</sup>浓度过高,NDA不易变性,>10mmol/L可抑制[[酶活性]]40%-50%。⑤多聚酶:Taq多聚酶从[[嗜热菌]]分离得到(1989年,在此以前1985年利用Klenow酶因不耐热每经过一次[[热变性]]要补加一次酶),现在经[[基因]]克隆的[[重组体]]产物Taq酶最适pH8.3~8.8(室温8.3-8.4),反应温度75-80℃,95℃以上[[失活]]明显。无3′→5′校读活性,对SDS敏感(<0.01%活性也受到抑制,加[[吐温]]-20可抵制SDS抑制)。该酶有逆转录酶活性。⑥退火温度一般设定为Tm-5℃,但实际上与引物一级结构序列有关,设计不当可造成非特异性退火,而造成非特异扩增,此时应调整温度和相应的时间。⑦循环次数受到的影响因素较多,增加次数可提高灵敏度,但易出现非特异扩增。⑧PCR灵敏高,被检样品极易被污染,样品[[纯化]],扩增,检测区域应分开。房间应经常用紫外光照射。扩增物应定点丢弃,处理。 {{Hierarchy footer}} {{临床生物化学图书专题}}
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