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寄生虫学/寄生虫标本的保存
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{{Hierarchy header}} [[寄生虫]][[标本]]的保存,除制成玻片标本永久保存外,还可用以下各种保存方法。 一、[[原虫]]包囊和虫卵的保存 汞碘醛液10ml与粪便1g混匀后密封在瓶内,可保存其中的原虫包囊及虫卵数月之久,也可在经浓集法处理的粪便沉渣中加等量或1倍量的10%[[甲醛]]液(加热至70℃),摇匀,用[[石蜡]]封固瓶口。 二、[[蠕虫]]成虫的保存 '''1.[[线虫]]''' [[生理盐水]]洗净后用加热至70~80℃的70%[[酒精]]或巴氏液(甲醛3份,生理盐水97份固定,冷却后移至新的70%酒精或巴氏液中保存。小型线虫(如[[旋毛虫]]、[[蛲虫]]、[[钩虫]]等)宜用[[甘油]]酒精(70%酒精95ml,甘油5ml)加热固定,保存于80%酒精中;也可用[[冰醋酸]]固定约半小时后移入70%酒精或甘油酒精中保存。 '''2.[[吸虫]]''' 小型吸虫可置于小瓶中,加生理盐水,用力摇荡数分钟,倒去生理盐水,注入固定液。较大的吸虫应先放在[[薄荷脑]]酒精液(薄荷脑24g,95%酒精10ml)中,使虫体[[肌肉]]松弛,用[[载玻片]]压平后固定,或将洗净后的吸虫放在两片载玻片间用细线紧扎压平后固定。 固定一般用10%甲醛,24小时后移至5%甲醛中保存;或用70%酒精固定0.5~3小时,视虫体大小而定,再移至新的70%酒精中保存。 '''3.[[绦虫]]''' 大型绦虫(如猪、牛带绦虫)经清水洗涤数次后,在生理盐水(4℃)中经过数小时或过夜,虫体可完全伸展,此时以3%福尔马林固定,24小时后移至5%福尔马林中保存,必要时也可先用大玻璃板压平后固定。小型绦虫洗涤后可在3%福尔马林中固定3~5小时,用载玻片轻压,沿[[盖玻片]]边缘加5%甲醛固定数小时,最后保存在5%福尔马林溶液中。 三、昆虫的保存 '''1.[[干标本]]保存'''系保存[[有翅昆虫]]成虫。可用特制的昆虫针针插虫体。大型昆虫(蝇、虻等)用1~3号昆虫针,从虫体背面、[[中胸]]右侧直插(图21-9)。注意保持左侧完整,以便鉴定。小型昆虫(蚊、蛉、蚋、蠓等)可用00号短针自[[胸部]]腹面两中足基部之间插入,不可刺透胸背,再用另一[[长针]]从软木片另一端插下。最后各插一硬纸片,记录名称、采集地点与时间,并将之插于昆虫盒软木板上或玻璃管的软木塞上。昆虫盒内放入纸包的[[樟脑粉]]即可。如标本数量多(图21-9),可保存于塑料管(或玻璃管)中,管底放少量樟脑粉,再铺上[[棉花]]、滤纸各一层,昆虫标本放于滤纸上,用软棉纸包棉花,轻塞在昆虫标本上方,瓶口加软木塞,再以蜡封之。 {{图片|gleygk18.jpg|有翅昆虫针插法}} 图21-9 有翅昆虫针插法 '''2.湿标本保存'''用于保存有翅昆虫的卵和幼虫期及无翅昆虫和[[蜱螨]]类的发育各期。活标本先经加温的70%酒精(60~70℃)固定,一天后保存于5%甘油酒精(7%)中;也可用5%或10%福尔马林和Bless液固定保存。 所有保存标本须详细记录标本名称、[[宿主]]、采集地点、采集日期及采集者姓名。 [[樟脑]]混合剂配制:樟脑粉6份,[[氯仿]]1份,[[木馏油]]1份,[[石蜡油]]4份。先将樟脑粉1.5份与氯仿1份混合,随后加樟脑1.5份与木馏油1份,用玻璃棒混匀,最后加樟脑粉3份及石蜡油4份,再搅匀备用。此混合剂易燃,宜置于严密而不透气的瓶内储藏。 常用固定液配制: ⑴酒精:通常用70%或75%酒精为固定液。用商品供应95%酒精作稀释配制。取95%酒精加至需要稀释的浓度,再加[[蒸馏水]]到95ml即可;或者,可按下列稀释公式配制: 所需酒精浓度 ×配成酒精量=所需原酒精量(ml)原酒精浓度 配成酒精量-所需原酒精量=应加蒸馏水量(ml) ⑵福尔马林(37%~40%的甲醛水溶液):常用固定液的浓度为5%~10%。如需保持中性,在配制过程中,可在500ml原液(37%~40%的甲醛水溶液)加入约2cm厚[[碳酸镁]],或放几小块大理石([[碳酸钙]])中和之;也可采用下列配方配制(10%福尔马林):福尔马林原液100ml,蒸馏水900ml,碳酸二氢钠([[Na]]<sub>2</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>.H<sub>2</sub>O)4g,碳酸氢二钠(Na<sub>2</sub>H<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>)0.5g混合配成。 ⑶布氏(Bless)液:福尔马林原液7ml,酒精(70%)90ml,冰醋酸(临用前加入)3~5ml混合配成。 四、原虫[[低温]]保存 用液氮保存原虫,具有保持原虫[[生物学]]特性,且保存时间较长的优点。现仅介绍[[疟原虫]]、弓形虫、人毛滴虫及[[阴道]]毛滴虫的低温保存方法。 '''1.冻存方法''' 恶性疟原虫:将从受染者采得的抗凝含虫血或体外培养的[[培养物]],经1500rpm离心10分钟,加入与沉积[[细胞]]等量的24%二甲基[[亚砜]](DMSO)生理盐水溶液(0.9%生理盐水或5%[[葡萄糖]]生理盐水76ml中加入DMSO24ml)保护剂,充分混匀后在室温中放置30分钟,按0.5~1.0ml分装入[[无菌]][[安瓿]](或塑料管)内,封口(或盖严)后将之放入标明批号的[[纱布]]袋中,装于液氮罐的提筒内,先置于液氮罐的[[颈部]],该处约为-70℃,30分钟后,置液氮中(-196℃)冻存。 鼠疟原虫:从[[感染]]疟原虫第3~4天的小鼠[[心脏]]取血(或摘除[[眼球]]取血),注入[[试管]],[[肝素]]抗凝,加入等量的10%或15%DMSO及15%或20%小牛[[血清]]为保护剂;或加入等体积的甘油、[[山梨醇]]保护液(4.2%山梨醇生理盐水180ml加纯甘油70ml),充分混匀。按照上法装管及冻存。也可以在1mm<sup>3</sup>阳性鼠血加0.1mm<sup>3</sup>的3.8%[[枸橼酸钠]]抗凝之后就装于液氮罐提筒中,立即直接置液氮中保存,2年内多数原虫仍有活力。 弓形虫:用[[无菌注射器]]吸取10%DMSO2ml,注入感染4天的小鼠腹腔,抽洗2次,抽出液混匀后即注入无菌塑料管内(0.5~1ml/管),冻存法同上。 阴道毛滴虫:用无菌拭子取[[阴道分泌物]],放入[[培养基]]中培养48小时,转种于RPMI-1640培基中2天。取含虫[[培养液]]经1000rpm/min离心10分钟,在沉淀中加入10%DMSO2ml,同上法分装及冻存。 人毛滴虫:取[[腹泻]]患者的含虫粪便培养于洛氏培养基中48小时,转种于洛氏培养基或RPMI-1640培养基中培养2天后计算虫数(达7×10<sup>5</sup>)。加等量10%DMSO并加Tween-20于DMSO中。装管同上法。但冻存过程应先将小管置于-10℃中15分钟,移到液氮罐颈2分钟,再置入液氮中冻存。 上述所用的保护剂(液)均应经[[高压灭菌]],保存于4℃冰箱。RPMI-1640配制50%DMSO,用时再稀释所需浓度,加15%或20%小牛血清,调pH至7.2。 '''2.[[复苏]]与观察'''在冻存1~2年,需要时从液氮罐中取出保种的小管,迅速投入37~40℃温水中,经4~5分钟即溶化。取冻存的鼠疟原虫和弓形虫分别经腹腔[[接种]]2只小鼠,每只ml,观察致病情况;也可接种后4~5天分别取鼠血或腹腔液,作[[涂片]],姬氏液[[染色]],[[镜检]]原虫。两种毛滴虫可用同样方法复苏,但需经培养3~4天后,作涂片镜检活动[[滋养体]],或染色观察。 {{Hierarchy footer}} {{人体寄生虫学图书专题}}
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