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基因诊断与性病/艾滋病诊断
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{{Hierarchy header}} '''一、诊断依据:''' (一)[[流行病学]]及[[临床表现]] (二) [[实验室检查]] (1)主要是中度以上[[细胞免疫]]缺陷包括:CD4+T [[淋巴细胞]]耗竭:T淋巴细胞功能下降,外周[[血淋]]巴[[细胞]]显着减少,CD4&lt;200/μl,CD4/CD8&lt;1.0,(正常人为1.25~2.1),迟发型[[变态反应]]皮试阴性,[[有丝分裂]]原[[刺激反应]]低下。 (2)B淋巴细胞功能失调:多克隆性[[高球蛋白血症]],[[循环免疫复合物]]形成和[[自身抗体]]形成。 (3)NK细胞活性下降 (4)各种[[致病性]][[感染]]的[[病原体]]检查如PCR。[[组织学]]证实的[[恶性肿瘤]],如KS; (三)[[HIV]][[抗体]]检测 1.[[酶联免疫吸附法]](ELISA);2.[[明胶]]颗粒[[凝集]]试验([[PA]]);3.[[免疫荧光]]检测法(IFA);4.[[免疫]]印迹检测法(Western Blot,简称WB法);5.放射免疫沉淀法(RIP)。其中前三项常用于筛选试验,后二者用于确证试验。HIV感染后数周或数日内常不能检出抗体,95%的受染者在5个月内可测出抗体。但也有感染后3-4年仍不能检出抗体者,此时有必要检测HIV[[病毒]]。 (四)PCR技术检测HIV病毒 1.[[标本]]的采集与模板[[核酸]]的制备。从怀疑为[[AIDS]]和ARC患者以及无症状的同性恋者采集[[血液标本]],分成两份,其中一份送往检测实验室与Glyciegel混合进行常规检验或者在-20~-80℃保存。另一份可在冻存之前通过聚[[蔗糖]](Ficoll)离心分离,收集沉积细胞。此法亦适用于疑为HIV感染的母亲及出生6个月以上的[[新生儿]]的血液标本。 可采用下述方法自血液标本中分离外周血[[单核细胞]](PMC): ① 取4ml[[血液]]用Hanks液1:1稀释。 ② 向含有1份[[淋巴细胞分离液]]的[[试管]]内轻轻加入两分稀释的血液,勿搅乱分层。 ③ 2500r/min离心20min。 ④ 吸出介于淋巴细胞分散液和[[血浆]]层间的PMC层,再用Hanks液洗两遍。 ⑤ 加入RPMI-1640生长液(10%胎[[牛血清]],10%[[白介素-2]],2μg/mlpolyberen 及2.5μg/ml的植物血[[凝集素]]P),使细胞浓度为2×106/ml。 ⑥ 置5%CO2的孵箱内于37℃培养2~3d,作为HIV分离的[[靶细胞]]。 2.模板核酸的提取。制备PCR模板核酸有多种方法,但其基本原理大致相同,使用的[[试剂]]因采取的方法不同而异。这里分别介绍两种从外周血单核细胞中提取[[DNA]]和[[RNA]]的方法。 (1)从外周血单核细胞中提取DNA 方法A: ①取1ml经37℃快速解冻的Glyciegel冻存细胞置一支小[[离心管]]内。 ②加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI-1640溶液洗一次。 ③2500r/min离心10min,弃上清。 ④沉淀的细胞用PBS洗两次,最后将细胞悬浮在溶液A(100mmol/KCl,10mmol/LTris-HCl,pH8.3)中,使细胞浓度为6×106/ml。 ⑤加入等体积的溶液B(10mmol/LTris-HCl,pH8.3,2.5mmol/l MgCl2,10%Tween20,10%NP-40)。 ⑥ 于37℃保湿后置冰箱保存。 该方法也适用于无Glyciegel保存的[[肝素]]标本及新鲜样品经聚蔗糖-400离心制备的淋巴细胞DNA的提取。 方法B: ①取4ml经37℃快速解冻的Glyciegel标本。 ②2500r/min离心10min,收集沉淀的细胞,[[上清液]]可作[[血清学]]研究用。 ③用10ml0.9%NaCl(含50%[[葡萄糖]])将沉淀的细胞洗一次。 ④再用10ml 0.9%NaCl(含50%葡萄糖)洗两次。 ⑤通过聚蔗糖-400离心,分离单核细胞。 ⑥将单核细胞悬浮于0.5ml裂解[[缓冲液]](10mmol/L,Tris-HCl pH8.3,10mmol/L EDTA,10mmol/L NaCl,0.5%SDS,100μg/ml[[蛋白酶]]K)中使细胞裂解。 ⑦用酚一[[氯仿]]抽提两次,将水相转移到一支新的离心管内。 ⑧加入3倍体积的[[无水乙醇]],于-20℃放置20min,13000r/min离心10min,弃上清,沉淀物经真空干燥后,用100μl蒸H2O溶解,于-20℃保存。 该方法也适用于标本经聚蔗糖-400离心制备的单核细胞DNA的提取。 (2)从外周血单核细胞中提取RNA及其[[反转录]] 方法A: ① 5ml血液标本,通过聚蔗糖-400离心制备外周血单核细胞。 ② 将细胞悬浮于10mlRPMI-1640离心制备外周血单核细胞。 ③ 2500r/min离心20min,收集沉积细胞。 ④把细胞悬浮于一定体积的预冷的裂解缓冲液(0.4mmol/L NaCl,10mmol/l Tris-HCl,pH8.3,1.5mmol/L MgCl2,0.5% NP-40)中,使细胞浓度为104/ml。 ⑤ 13000r/min,于4℃离心10min,收集上清液。 ⑥ 把含有RNA的上清液转移到一支新管内,立即置-80℃保存,备用。 在RNA反转录前,先将RNA样品用DNase处理,除去样品中残留的DNA。经反转录得到的cDNA即可进行PCR[[扩增]]。RNA反转录操作如(7)~(9)。 ⑦ 取10μlRNA样品加2.7UDNase I。 ⑧ 于37℃保温10min,93℃10min,立即放入冰浴中冷却。 ⑨ 另将一份DNase I处理过的RNA样品,加入RNase A(15μg/份),37℃保温10min,置-20℃保存。 方法B: ①取5ml新鲜血浆置一支离心管内。 ②40000r/min,4℃离心10min,收集沉淀。 ③将沉淀物溶于变性液(4.0mmol/L异硫氰酸胍,25mmol/L[[柠檬酸]]缓冲液pH7.0,0.5sarcosyl,0.1mmol/L2-巯基[[乙醇]])中充分混匀. ④加入30μl2mmol/L[[乙酸]]钠缓冲液pH4.2,400μl酚和80μl氯仿/异[[戊醇]]混合液(24:1),萃取1min,冰上放置20min. ⑤13000r/min离心20min. ⑥轻轻将水相转移到一支新管中. ⑦加入3倍体积的无水乙醇,-20℃放置1h左右. ⑧13000r/min,4℃离心15min,收集沉淀. ⑨沉淀物用75%乙醇洗涤两次,[[真空干燥]]. ⑩加入10μl 水溶解,立即置-80℃保存或者反转录. ⑾ 取10μl RNA样品. ⑿ 加入10μl 1×PCR缓冲液(50mmol/LNaCl,10mmol/L Tris - HCl,pH8.3,1.5mmol/L MgCl2 0.01%明胶),各0.2mmol/L四种dNTP,10pmol/GN GHd QLP GX PUH R XHHTR 39,20URNA酶抑制剂(RNsin),10U的AMV[[逆转录酶]]。 ⒀ 42℃保温30~60min,然后93℃5min. ⒁ 立即置冰浴中冷却,备用。 由上述方法制得的RNA反转录样品,通过10%[[聚丙烯酰胺凝胶电泳]]可鉴定其特异性。 '''二、PCR扩增步骤''' (一)[[引物]]的设计与合成 HIV PCR引物设计应遵寻引物设计的一般原则。由于HIV[[基因]]易发生[[变异]],因而引物应在保守区内设计,一般在pol、evn、gag、tat基因中的核酸序列内设计,HIV感染的细胞往往很少,要从106个正常细胞中检出1个HIV感染细胞,PCR扩增的引物首先要具有特异的结合HIV相应基因能力,同时一般要采用巢式-PCR方法,来提高检测的灵敏性。 检测HIV引物的第二步骤就是扩增HIV感染细胞中的原病毒DNA。感染细胞与未感[[细胞混合]]得到连续的10倍感染细胞的[[稀释液]]。通常由103/106个感染细胞稀释至1/106个感染细胞。同时用其它[[逆转录病毒]]感染细胞的DNA作对照,进行PCR扩增。然后通过Southern杂交及DNA序列分析,进一步确定扩增产物的特异性。 已经被确定的保守区是gag,tat,evn,pol基因中的某些[[核苷酸序列]]。在用于临床标本检测之前,要对引物的特异性进行鉴定。通常取100pg含有HIV[[基因组]]序列的[[质粒]]DNA稀释液和2μg载体[[鲱鱼]]精DNA。如引物是特异的,它们就会指导单一的双股DNA片段的合成。合成的DNA片段相对应于两引物5′末端之间距离。如果是另一种DNA模板,就不会合成任何DNA片段。如果合成的DNA片段不是所预期的或除了有所预期的片段还有其它的DNA片段,那么可以考虑对PCR的条件进行某些改进,看是否能改善其特异性,否则要另选引物。 表6-20 用于HIV PCR扩增的引物及[[探针]] {| class="wikitable" | 引物及探针 | 序列(5′3′) | 基 因区 | 片段(bp) |- | SK38 | ATAACCACCTATCCCAGTAGGATAAAT | gag | 115(HIV1) |- | SK39 | TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC | | |- | SK19(P) | ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC | | |- | SK145 | AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT | gag | 141(HIV1) |- | SK101 | GCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTC | | 139(HIV2) |- | SK102(P) | GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT | | |- | SK145 | AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCCATGCAAAT | gag | 142(HIV1) |- | SK150 | TGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTC | | 139(HIV2) |- | SK102(P) | GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT | | |- | O-1 | GGGCAAATGGTACATCAGGCCATATCAC | gag | 525(HIV1) |- | O-2 | TTTTACCTCCTGTGAAGCTTGCTCGGTC | | |- | I-2 | TTGGTCCTTGTCTTATGTCC | gag | 422(HIV1) |- | I-1 | TTAATACGACTCACTATAGGGTAGAAGAGAAGGCTTTCAGC | | |- | GK55 | CCTGCTATGTCACTTCCCCT | gag | 190(HIV1) |- | GK56 | TTATCAGAAGGAGCCACCCC | | |- | P-1 | TTCTGTCAATGGCCATTGTTTAACTTTTGGGCCAT | pol | 355(HIV1) |- | P-2 | TAAAGGAAGCAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGCTGA | | |- | SK29 | ACTAGGGAACCCACTGCT | Itr | 105(HIV1) |- | SK30 | GGTCTGAGGGATCTCTA | | |- | SK31(P) | ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACT | | |- | P13 | TGGCGCCCGAACAGGGAC | LTR | 168 |- | P14 | TACCCACGCTCTCGCAG | | |- | SK89 | AGGAGCTGGTGGGGAACG | LTR | 165(HIV2) |- | SK90 | GTGCTGGTGAGAGTCTAGCA | | |- | SK91(P) | TTGAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCAGGTAG | | |- | SK68 | AGCAGCAGGAAGCACTATGG | env | 142(HIV1) |- | SK69 | CCAGACTGTGAGTTGCAACAG | | |- | SK70(P) | ACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGT | | |- | CO1 | ACAATTATTGTCTGGTATAG | env | 135(HIV1) |- | CO2 | AGGTATCTTTCCACAGGCAG | | |- | CO3(P) | TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAG | | |- | CO71 | TGTGGAGGGAATTCTTCTACTGTAA | env | 320(HIV1) |- | CO72 | TATAGAATTCACTTCTCCAATTGTCCCTCAT | | |- | CO75(P) | GAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAA | | |} (二)PCR扩增步骤 1.扩增条件 当选择的引物影响其特异性和扩增效果时,首先应考虑扩增的条件是否适宜。这些条件包括退火温度,PCR循环数,反应物浓度等。扩增的条件通常是1~4mmol/LMgCl2,0.5~1.0mmol/ldNTP,每100μl反应体积2~4U Taq DNA[[聚合酶]],2μgBSA,10pg靶DNA,扩增25~30循环,退火温度为37℃,引物浓度6μg/ml。在37~55℃之间变更退火温度可以找到提高产量和特异性的最佳温度.尽管每个实验室使用的扩增条件略有差异,但它们的原理都是相似的。 2.扩增的步骤 (1)取10μl (1.2μg)HIV-DNA样品。 (2)用10μl 1×PCR缓冲液(100mmol/LTris-HClpH8.8,500mmol/l KCl,2mmol/L MgCl<sub>2</sub>,16mmol/LDTT)。 (3)加入10μl ,各1mmol/LdNTP,6.6μg/ml引物。 (4)反应混合物于93℃变性处理7min。 (5)冷却至室温,加入4UTaqDNA聚合酶,反应最终体积为100μl。 (6)加入50μl矿物油,离心10s。 (7)置70℃保温5min。 (8)PCR扩增25个循环,95℃1min,55℃1min,70℃ 1min,最后于70℃延伸10min。 PCR检测出现[[假阴性]]的原因有:标本中的HIV-DNA量极少,未能有效地扩增或扩增产物达不到检测水平;DNA模板和PCR产物未能完全变性,使得引物不能或较少与DNA片段结合,从而降低了最终产物的产量。如果临床标本中的HIV基因发生变异,也会出现假阴性。PCR[[假阳性]]的原因主要有:标本的交叉污染;重复使用不干净的器具。此外还要合理设置对照,阴性对照用无HIV-DNA标本的反应混合液,阳性对照用已知的HIV-DNA。 '''三、扩增产物的检测和分析''' 扩增产物的检测和分析可采用[[凝胶电泳]],[[限制性内切酶]]图谱,DNA序列分析及[[分子杂交]]等技术。 (一)凝胶电泳分析 根据所采用的引物对之间DNA片段的长度,预计PCR产物的[[分子]]大小。通过与凝胶电泳后的DNA片段相比较,可初步判断PCR产物的特异性,然后将产物用限制性内切酶水解,进一步确定扩增产物的特异性。 (二)分子杂交分析 分子杂交既是检测PCR产物特异性的一种较好的方法,也是检测扩增产物的非限制性内切酶[[位点]]上[[碱基]][[突变]]的有效方法。分子杂交法是根据标记探针与两条引物链之间特异DNA片段的互补性进行的。结果阳性说明PCR产物是特异性的。可利用多种[[等位基因]]特异性[[寡核苷酸探针]]与PCR产物进行分子杂交,检测PCR产物的碱基突变。现将检测HIV-DNA的PCR扩增产物常用的几种分子杂交技术分别介绍如下: PCR[[扩增技术]]和分子杂交的敏感性。 PCR技术检测HIV具有敏感性高,特异性强的优点。该方法可检测血液及组织标本中微量的HIV及前病毒序列。如对HIV-1感染H9细胞的扩增产物进行液相杂交和EB[[染色]]的电泳[[凝胶]]来检测PCR技术的灵敏性。可检测到0.05感染细胞的RNA量(相当于5个感染H9细胞的HIV-1-RNA/5×106个未感染细胞)。 '''四、PCR技术在HIV检测中的应用''' PCR可用来追踪HIV的自然感染史。可在其它血清学和[[病毒学]]标志出现前检测病毒序列,这样可判定无症状而且[[血清]]阴性患者潜在的HIV的传播性;可用来监测长[[潜伏期]](4~7年)病人,以及在抗病毒治疗期间病毒的水平;也可用于HIV-1血清阳性母亲的[[婴儿]]的HIV检测。在婴儿出生后最初的6~9个月期间,他们的血液中存在母体的抗体,因此用PCR可判定婴儿是否真正被HIV感染。 (一)[[血清抗体]]阳性病人HIV序列的检测 有人从AIDS或ARC病人的外周血单核细胞[[培养物]],[[精液]]细胞和精液上清制备DNA。然后用PCR法和逆转录酶测定法分别检测HIV-1。PCR扩增产物与32P标记的探针退火之后用BstNI[[消化]]。再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和自显影。结果表明,在逆转录酶阴性的28个[[细胞系]]中有9个以及用逆转录酶法不能确定的9个细胞系中有2个为阳性。这说明过去许多[[细胞培养]]物认为是阴性者,实际上用更敏感的PCR测定时则为阳性。 从血清阳性的HIV感染者的外周血单核细胞中可检测出前病毒序列。通过共培养分离出病毒的血清阳性的同性恋男人血液制备的DNA,用PCR可100%检出病毒序列;用血清阴性共培养阴性同性恋者的标本,经PCR扩增检出病毒序列者为64%,血清阴性正常人标本PCR检测也为阴性,表明未出现假阳性结果。由于HIV-1基因组的广泛的[[异源性]],为提高检测的阳性率可采用多种引物(如LTR,gag和env基因的引物)。利用PCR法从313份已证实为抗体阳性的标本中检测出310份HIV阳性(99%)。 (二)血清抗体阴性病人的HIV序列的检测 由于在感染HIV后到出现[[免疫反应]]之前有一段滞后期,这个血清学阴性的滞后期通常长达6周至6个月,而且无抗体产生期可能更长些.在此期间受感染者往往检测不到抗体,因此,血清阴性的人也可能已感染HIV.PCR法在[[高危人群]]中检测到HIV-1比由血清学转阳确诊的时间可以提高6个月对少数初次共培养呈阴性的人,甚至可在血清转阳之前24~39个月就能确诊为HIV-1感染.对血清学试验结果不能确定者,也可通过PCR作进一步分析和确诊。 (三)新生儿HIV序列的检测 HIV感染的母亲其婴儿由于母体抗体的存在,用抗体检测法通常为阳性.但实际上只有20%~60%的婴儿受到HIV感染.因此,对这些婴儿进行HIV感染的早期诊断是十分重要的.现已证明30~50%的这些新生儿可在母亲的[[子宫]]里,在[[分娩]]和[[引产]]或通过产后哺乳时从其母体感染HIV.新生儿血清阳性者并不能说明是HIV感染.因为母体HIV抗体可持续大约15个月久.在一般情况下,婴儿并不表现出HIV感染的任何[[症状]].病毒细胞培养法对婴儿并不是一种可靠实用的方法;HIV特异IgM抗体的检测在母体抗体存在下也是不可能的;在过量血清抗体存在下检出血清中的HIV[[抗原]]也是十分困难的.另外,婴幼儿被HIV感染后病情发展较快.早期诊断,对及时采取治疗措施,延缓阻止病情发展极为重要.目前所使用的抗病毒药[[毒性]]大,因而不能用于HIV抗体阳性而未感染的婴幼儿.但当用PCR检测出HIV-DNA序列后,即可进行抗病毒治疗以及加强免疫机能和营养的治疗.在一项研究中,14名血清阳性母亲的新生儿用PCR检测其中6个为阳性;在出生后12~15个月内血清阴性的10个儿童中有5个为PCR阳性.从血清阳性母亲出生1个月的新生儿中,收集的外周血单核细胞经PCR检测,7个为阳性的婴儿,其中5个在检测后10个月得AIDS;而PCR阴性的9个婴儿,在16个月的追踪检查期间身体状况良好.这些研究表明,PCR技术对被HIV感染母亲的新生儿和血清阴性儿童进行早期的直接的HIV-1检测是十分重要的. PCR技术检测HIV-DNA序列对AIDS和ARC的确诊起着重要作用.但也有人认为对已知HIV抗体、抗原或培养阳性的病人不必再做PCR。最合适的PCR检测对象是那些疑有HIV感染但又缺乏确切的血清学依据的人群,如上述的HIV阳性母亲所生的婴儿,阳性患者的性伴侣,[[静脉吸毒]]者和可疑的[[血清反应]]者。PCR技术还可用来检测[[血液制品]]及[[疫苗]]中有无HIV。 '''五、[[艾滋病]]诊断标准:''' 1.[[艾滋病病毒]]抗体阳性,又具有下述任何一项者,可为实验确诊艾滋病病人。 (1)近期内(3-6个月)[[体重减轻]]10%以上,且持续[[发热]]达38℃一个月以上; (2)近期内(3-6个月)体重减轻10%以上,且持续[[腹泻]](每日达3-5次)一个月以上。 (3)[[卡氏肺囊虫肺炎]](PCR) (4)[[卡波济肉瘤]]KS。 (5)明显的[[霉菌]]或其他条件致病感染。 2.若抗体阳性者体重减轻、发热、腹泻症状接近上述第1项时,可为实验确诊艾滋病病人。 (1)CD4/CD8(辅助/抑制)[[淋巴细胞计数]]比值&lt;1,CD4[[细胞计数]]下降; (2)全身[[淋巴结肿大]]; (3)明显的[[中枢神经系统]]占位性病变的症状和[[体征]],出现[[痴呆]],辩别能力丧失,或[[运动神经]][[功能障碍]]。 {{Hierarchy footer}} {{基因诊断与性传播疾病图书专题}}
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