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基因诊断与性病/核酸探针的种类
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{{Hierarchy header}} (一)[[DNA]][[探针]] DNA探针是最常用的[[核酸]]探针,指长度在几百[[碱基对]]以上的双链DNA或[[单链DNA]]探针。现已获的DNA探针种类很多,有[[细菌]]、[[病毒]]、[[原虫]]、[[真菌]]、动物和人类[[细胞]]DNA探针,这类探针多为某一[[基因]]的全部或部分序列,或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的,如细菌的[[毒力]]因子[[基因探针]]和人类ALU探针,这些DNA探针的获得有赖于[[分子克隆]]技术的发展和应用。以细菌为例,目前[[分子杂交]]技术用于细菌的分类和菌种鉴定比用G+C百分比值要准确的多,是细菌[[分类学]]的一个发展方向,加之分子杂交技术的高度敏感性,分子杂交在临床性病[[病原体]]诊断上具有广泛的前景。 DNA探针(包括cDNA探针)有三大优点:第一,这类探针多克隆在[[质粒]]载体中,可以无限繁殖,取之不尽,制备方法简便。其次,DNA探针不易降解(相对[[RNA]]而言),一般能有效抑制DNA[[酶活性]]。第三,DNA探针的标记方法较成熟,有多种方法可供选择,如[[缺口平移]]法、随机[[引物]]法、PCR标记法等,能用于[[同位素]]和非同位素标记。 (二)cDNA探针 cDNA是指互补于mRNA的DNA[[分子]](complementary DNA)。cDNA是由RNA经一种称为[[逆转录酶]]的DNA[[聚合酶]][[催化]]产生的。携带逆转录酶的病毒侵入[[宿主]]细胞后,病毒RNA在逆转录酶的催化下转化成双链cDNA,并进而整合入宿主细胞[[染色体]]DNA分子,随宿主细胞DNA复制同时复制,这种整合的[[病毒基因组]]称为原病毒。在静止状态下,可被复制多代,但不被表达,故无毒性,一旦因某种因素刺激而被[[活化]],则该病毒大量复制。如其带有[[癌基因]],还可能诱发细胞[[癌变]]。 [[逆转录]]现在已成为一项重要的分子[[生物学]]技术,广泛用于基因的克隆和表达。从[[逆转录病毒]]中提取的逆转录酶也已商品化。最常用的有AMV逆转录酶。利用[[真核]]mRNA3′末端存在一段[[聚腺苷酸]]尾,可以合成一段[[寡聚]][[胸苷酸]]用作引物,在逆转录酶催化下合成互补于mRNA的cDNA链,然后再用RNaseH将mRNA[[消化]]掉,再加入[[大肠杆菌]]DNA聚合酶I催化合成另一条DNA链,即完成了从mRNA到双链DNA的逆转录过程。 所得到的双链cDNA分子经S1[[核酸酶]]切平两端后接一个有限制酶切点的接头(Adapter),再经特定[[限制酶]]消化产生[[粘性末端]],即可与含互补末端的载体进行连接。常用的[[克隆载体]]是λ[[噬菌体]]DNA,如λgt、EMBL和Charon 系列等。用这类载体可以得到包含105以上转化子文库,再经前面介绍的筛选方法筛选特定基因克隆。用这种技术获得的DNA探针不含有[[内含子]]序列。因此尤其适用于[[基因表达]]的检测。 (三)RNA探针 RNA探针是一类很有前途的核酸探针,由于RNA是[[单链]]分子,所以它与靶序列的[[杂交反应]]效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针,这些RNA是在细胞基因[[转录]]或[[病毒复制]]过程中得到标记的,标记效率往往不高,且受多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的,而不是用于检测。例如,在筛选逆转录病毒[[人类免疫缺陷病毒]]([[HIV]])的[[基因组]]DNA克隆时,因无DNA探针可利用,获得HIV的全套标记mRNA作为探针,成功地筛选到多株HIV基因组DNA克隆。 随着体外逆转录技术不断完善,已成功的建立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一类新型载体PSP和PGEM,这类载体在多克隆[[位点]]两侧分别带有SP6[[启动子]]和T7启动子,在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可进行RNA转录。如果在多克隆位点接头中插入了外源DNA片段,则可以以DNA两条链中的一条为模板转录生成RNA。这种体外转录反应效率很高,在1小时内可合成近10μg的RNA产物。只要在[[底物]]中加入适量的[[放射性]]或[[生物素]]标记的dUTP,则所合成的RNA可得高效标记。该方法能有效地控制探针的长度并可提高标记分子的利用率。 RNA探针和cDNA探针具有DNA探针所不能比拟的高杂交效率,但RNA探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。 (四)[[寡核苷酸探针]] 前述三种探针均是可克隆的,一般情况下,只要有克隆的探针,就不用寡核苷酸探针。在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制[[酶谱]]和测序时,也常应用克隆探针。克隆探针一般较寡核苷酸探针的特异性强,复杂度也高,从[[统计学]]角度而言,较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少。克隆探针的另一优点是,可获得较强的杂交信号,因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测[[标记基因]]更多。但是,较长的探针对于靶序列[[变异]]的识别能力又有所降低。对于仅是单个[[碱基]]或少数碱基不配的两个序列,克隆探针不能区分,往往杂交信号相当。这既是其优点,又是其缺点,优点是当用于检测病原[[微生物]]时,不会因病毒或细菌DNA的少许变异而漏诊,缺点则是不能用于检测[[突变]]点。这种情况,通常要采用化学合成的寡核苷酸探针。 合成的寡核苷酸探针具有以下特点:第一,由于链短,其序列复杂度低,[[分子量]]小,所以和等量靶位点完全杂交的时间[[比克]]隆探针短。第二,寡核苷酸探针可识别靶序列内一个碱基的变化,因为短探针中碱基错配能大幅度降低杂交体的Tm值。第三,一次可大量合成寡核苷酸探针,使得这种探针价格低廉,与克隆探针一样,寡核苷酸探针能够用酶学或[[化学]]方法修饰以进行非放射性[[标记物]]的标记。最常用的寡核苷酸探针长18-40个硷基,目前的合成可有效地合成至少50个碱基的探针。 对于合成的寡核苷酸探针有以下要求: (1)长度以18-50碱基为宜,较长探针杂交时间较长,合成量也低;较短探针特异性较差。 (2)碱基成分:G+C含量为40%-60%,超出此范围则会增加非特异杂交。 (3)探针分子内不应存在互补区,否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。 (4)避免单一碱基的重复出现。 (5)一旦选定某一序列符合上述标准,最好将该序列与核酸库中的核酸序列比较,探针序列应与靶序列核酸杂交,而与非靶区域的[[同源性]]不应超过70%或有连续8个或更多的碱基的[[同源]]。否则,该探针不能用。 {{Hierarchy footer}} {{基因诊断与性传播疾病图书专题}}
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