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临床生物化学/基因库的建立
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{{Hierarchy header}} 建立[[基因库]]的目的是为了便于目的[[基因]]的保存、[[扩增]]和[[纯化]]。基因库是利用工具酶,通过[[基因重组]]技术和转化、筛选而建立,也是基因克隆的过程。实际上是利用低等[[生物]]如[[细菌]]、[[病毒]]、[[噬菌体]]等生长快,繁殖力强的特点,而作为一种[[核酸]]扩增筛选的载体,把人类等高等生物的基因或其片段用工具酶插入,[[重组]]于其中,经筛选,克隆得到目的基因与载体重组的重组基因,成为便于保存,取用方便的基因库。基因库交流是研究室之间交流目的基因的常用方式。 '''(一)基因重组''' 基因重组方案很多,简单的可用同一种[[限制性内切酶]]分别在载体和目的基因切出相对应的切口,便于连接。也可用末端[[连接酶]]合成连接器(图18-3)。近年,Okayama方案为实验室普遍采用,该方法可得到全长的cDNA。 '''(二)转化''' 转化目的是把有复制能力,但在[[细胞]]外无复制活性的目的基因-载体[[重组体]]装入细胞([[大肠埃希菌]]),使目的基因随载体在细胞内复制、扩增。实验步骤介绍如下: {{图片|gor4ty0a.jpg|基因重组方案之一}} 图18-3 基因重组方案之一 ⒈大肠埃希菌的处理(增加[[细胞膜]]通透性,便于基因进入细胞)大肠埃希菌(E.Coli cells)[[接种]]于Lb agar[[培养基]],37℃培养一晚。挑选3~5个大[[菌落]],接种于50ml LB培养基,37℃,振摇培养一晚后,在A<sub>550</sub>测定,要求[[细菌繁殖]]一定量(一般为细菌对数[[生长期]]),[[野生型]](rec+,5x10<sup>7</sup>cells/ml)为0.2-0.3,缺陷型(rec-,5x10<sup>7</sup>cells/ml)为0.5-0.6。离心弃去[[上清液]],用20ml,50mmol/L,CaCl<sub>2</sub>悬浮菌体。冰浴20分钟,[[低温]]离心。弃上清液,用2.5ml冰50mmol/l CaCl<sub>2</sub>悬浮。4℃可保存48小时,用于转化,称competent cells。 ⒉[[质粒]](如经基因重组建立的[[重组质粒]],基因库等)的转化 将competent cells(以美国BRL公司DH10B[[菌株]]为例)置冰水浴。同时将Falcon2059(传热系数稳定)[[塑料试管]]置冰水浴。取100μl菌液(DH10B)于2059[[试管]]中,加10倍稀释的[[巯基]][[乙醇]]1μl,冰浴轻摇2分钟,放置10分钟。取0.1-50ng质粒加入试管,轻轻摇匀,冰浴30分钟。此间备好42℃水浴。并将SOC培养基置42℃备用。将试管置于42℃,轻摇45秒钟,马上置冰浴2分钟。使competent cells热胀冷缩,把质粒导入菌体。加42℃SOC培养基0.9ml于试管,37℃培养1小时。1000rpm离心10分钟,弃上清液,用200μlSOC培养基悬浮菌体。接种于LB-[[氨芐青霉素]](100U/ml)[[培养皿]],37℃培养一晚。已转化的菌体可形成菌落(因质粒上有抗氨芐青霉素基因)。在了解目的基因或其产物的基础上对菌落进行鉴定。并在LB[[培养液]]中扩大培养。基因库的建立、转化、筛选、扩增、纯化的过程就是基因克隆的过程。 LB培养基(1L):10g[[蛋白胨]],5g[[酵母膏]],10gNaCl,[[高压灭菌]],pH7.5。 SOB培养基(1L):20g蛋白胨,5g酵母膏,0.5gNaCl,高压灭菌。另外准备2mol/L镁溶液(1mol/L[[氯化镁]]与1mol/L[[硫酸镁]]等量混匀,过滤[[灭菌]]),临用前加1ml于100ml培养基。 SOC培养基(100ml):临用前加入1ml过滤灭菌的2mol/L[[葡萄糖]]。 {{Hierarchy footer}} {{临床生物化学图书专题}}
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