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临床生物化学/基因工程的常用工具
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{{Hierarchy header}} '''(一)载体''' 载体(Vector)是把外源[[DNA]](目的[[基因]])导入[[宿主]][[细胞]],使之[[传代]]、[[扩增]]、表达的工具。载体有[[质粒]](plasmid)、[[噬菌体]]、[[单链]]丝状噬菌体和[[粘性末端]]质粒(粘粒)、[[病毒]]等。载体具有能自我复制;有可选择的,便于筛选、鉴定的[[遗传标记]];有供外源DNA插入的[[位点]];本身体积小等特征。 质粒存在于多种[[细菌]],是[[染色体]](核)以外的独立[[遗传因子]],由双链环状DNA组成,几乎完全裸露,很少有[[蛋白质]]结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA[[多聚酶]]Ⅲ复制,一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制,一个细胞可复制30-50个质粒,如果用[[氯霉素]]可阻止[[蛋白质合成]],使质粒有效利用原料,复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多,常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因,如复制起动区(复制原点Ori),便于复制扩增;抗[[抗生素]]标记(抗[[氨芐青霉素]]Ap<sup>r</sup>、[[抗四环素]]Tc<sup>r</sup>等)或大肠埃希菌部分[[乳糖]][[操纵子]](E.coli LacZ)等,便于[[基因重组]]体的筛选;基因发动子(乳糖操纵子Lac、[[色氨酸]]操纵子Trp等)和[[转录终止]]序列,便于插入的[[外源基因]][[转录]]、翻译表达。质粒上还有许多[[限制性内切酶]]的切点,即基因插入位点,又叫基因重组位点,基因克隆位点。 常用噬菌体载体有[[单链噬菌体]]M13系统;双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点,便于选择,灵活应用。 '''(二)工具酶''' 工具酶是基因重组技术不可缺少的工具。主要有限制性内切酶、[[连接酶]]、[[核酸]][[聚合酶]]、[[逆转录酶]]、[[核酸酶]]等。 限制性内切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA[[内切酶]]之分,Ⅱ型能严格识别核酸序列,并在识别区内特定的[[核苷酸]]处切开DNA双链。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA内切酶。识别分核苷酸和六核苷酸,其序列旋转对称。切口分开端和粘端,产生3′-OH和5′-P末端。内切酶品种多,使用时应注意温度、[[缓冲液]]用量(一般1μg DNA/2-5单位酶)等反应条件。 {| class="wikitable" | 酶 | 识别序列 | 切口 | |- | Alu Ⅰ | …AGCT… | …AG [[CT]]… | 四核苷酸 |- | | …TCGA… | …[[TC]] GA… | 平端切口 |- | Eco R1 | …GAATTC… | …G AATTC… | 六核苷酸 |- | | …CTTAAG… | …CTTAA G… | 粘端切口 |} 连接酶有[[T4]]噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体[[RNA]]连接酶、[[大肠埃希菌]]DNA连接酶等。DNA连接酶可连接平端,也连接粘端。反应需有[[Mg]]<sup>2+</sup>和[[ATP]]存在,pH7.5-7.6。最适温度37℃,30℃以下活性明显下降,但考虑到被连接DNa 的稳定性和粘性末端的退火温度,一般平端连接用20-25℃,粘端连接用12℃左右。 聚合酶有DNA聚合酶(以DNA为模板合成DNA大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ,大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow大片段),T4或T7噬菌体DNA聚合酶等);RNA聚合酶(以DNA为模板合成RNA,T7或T3噬菌体RNA聚合酶);逆转录酶(以RNA为模板合成DNA,除RNA病毒中发现外,发现大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有[[逆转录]]活性)。 大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′,3′→5′外切[[酶活性]]。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被[[枯草杆菌]]酶作用产生的一个大片段,有5′→3′[[聚合酶和]]5′→3′外切酶活性,无3′→5′外切酶活性。可用于缺口翻译(Nick translation)法标记核酸,也可用于DNA[[序列测定]],修补DNA链等。 核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等,可水解相应的DNA和RNA,核酸酶S1可降解[[单链DNA]]和RNA,用量增大也可降解双链核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中产生的[[发夹环]]。 [[末端转移酶]]在Mg<sup>2+</sup>存在下,选择3′-OH端单链DNA为[[引物]]加成核苷酸,在Co<sup>2+</sup>存在下,选择3′-OH端双链DNA为引物加成核苷酸,形成多聚核苷酸尾。常用于核酸[[末端标记]]和核酸连接的互补多聚尾(连接器)。 [[碱性磷酸酶]]去除5′-P,可防止二分子DNA片段5′端P基团自身空间障碍,影响DNA[[分子]]之间的连接,一般用碱性磷酸酶处理载体DNA除去5′端P基团,在连接酶作用下目的基因的5′端P先与载体3′端OH连接,再通过复制修复另一条链,使二条链完全连接。该方法大大提高了连接效率(图18-1)。 {{图片|gor4s1hc.jpg|经碱性磷酸酶处理后载体DNA与目的基因DNA的连接}} 图18-1 经碱性磷酸酶处理后载体DNA与目的基因DNA的连接 {{Hierarchy footer}} {{临床生物化学图书专题}}
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